膜蛋白
關注創建者：320科技工作室 創建時間：2022-08-27
膜蛋白的實例教程
今天以KALP15蛋白為例，主要介紹基于Gromacs進行膜蛋白體系的構建和模擬。
1. 蛋白結構預處理。首先通過可視化軟件（VMD、pymol等）檢查結構文件中的分子成分，去除不需要的組分。然后通過pdb2gmx命令講原始結構文件進行轉換并選擇相應力場。
2. 選擇合適的膜組分。根據自身需要選擇合適的磷脂成分（https://people.ucalgary.ca/~tieleman/download.html 可下載相關結構和力場）。并且在該步驟利用蛋白和磷脂力場構建需要的topol文件。
3. 選擇合適的蛋白和磷脂取向。由于膜蛋白的取向和在膜上的高度是固定的，因此要根據文獻報道確定合適的取向和位置。該步驟可使用trjconv和editconf等命令可以進行構象的調整。如圖所示
4. 磷脂對蛋白質的包裹。由于上個步驟中構建的體系僅僅是調整了取向，磷脂還是非常松散，因此需要將磷脂進行收縮堆積。這里參考使用了InflateGRO方法。通過genrestr命令對蛋白質進行位置限制，保證蛋白質位置不變，僅僅改變磷脂位置，讓其自身進行縮放，可縮放多次，直至達到結構的設定數值。
5. 模型構建完成之后，需要使用genion和solvate命令添加離子和水。但是此時需要注意，該步驟填充的水和離子會出現雙層膜之間，這種結構是不合理的，需要手動去除雙層膜熟睡核心的水分子。完成后結果如圖所示：
6. 隨后就可以通過grompp命令產生tpr文件并使用mdrun命令進行計算。
7. 結果分析：對于蛋白可以采用二級結構、RMSD等參數刻畫蛋白質特征，對于膜或者磷脂來說則可以通過序參數表征膜的有序程度例如有序相和無序相等。如圖所示：
也可以通過density命令分子膜的密度等特征。如圖所示：
在膜蛋白體系的模擬中，有許多其他的小問題需要注意。
展開 之前本公眾號介紹過GROMACS中膜蛋白體系的構建。按照官方的介紹，通過將磷脂構象盒力場準備好，然后在模擬盒子內進行磷脂的組裝，最后將蛋白嵌入在磷脂膜內。上述步驟雖然可以較為準確的構建模擬體系，但是并不方便調整，例如磷脂多樣性的選擇以及膜蛋白在膜內的位置和角度。本次向大家介紹一種方便的體系構建方法：利用CHARMM-GUI工具構建。
首先可以打開在線網站(https://charmm-gui.org/ )，找到輸入生成選項以及膜的構建選項。這里我們可以看到可以構建純磷脂膜體系，也可以構建膜蛋白-膜復合體系。在此我們以較為復雜的膜蛋白體系為例。
通過直接輸入蛋白的PDB ID。該網站就可以幫我們搜索到需要的蛋白
蛋白選擇之后，我們還可以選擇蛋白在膜內的的旋轉角度和平移方向及距離。
點擊下一步驟之后，我們可以看到磷脂類型的選項。該工具可以非常方便的選擇不同比例的磷脂類型。在此選擇上下層膜都為50%的DOPC和50%的POPC。確定體系大小并點擊顯示體系信息之后，我們可以明確看到磷脂雙層膜的組成成分和數量。并進一步選擇體系中的離子濃度和類型。
在構建過程中，我們可以預覽體系構型，并根據實際情況進行位置和角度的調整。該工具另外一個非常方便的地方在于可以很好的產生對應的力場，不需要自己去繁瑣的改動和增加。在此我們可以選擇力場類型，模擬軟件，溫度和系綜等細節信息。
最后我們可以查看此工具生成的mdp文件、立場文件、構型等文件。確認無誤之后便可以進行類似于之前介紹過的模擬。在此需要注意，此處存在多個預平衡文件，因為膜蛋白體系比較復雜，所以需要逐漸對體系進項平衡，保持模擬穩定性。
展開 圖2 a) 純黑色素納米粒子和紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子的磷鎢酸負染后的透射電鏡圖, 標尺為100 nm. b) 單個乳腺癌細胞和紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子共孵育后的共聚焦成像圖, 標尺為20 μm. c) 不同RBC與MCF-7膜蛋白比重的Melanin@RBC-M納米粒子在乳腺癌細胞中的流式直方圖. d) 紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子和純黑色素納米粒子的藥代動力學曲線. e) 紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子和純黑色素納米粒子對MCF-7腫瘤的抑制生長. f) 不同尺寸Melanin@RBC-M 納米粒子的光聲信號圖譜. g-h) 不同尺寸Melanin@RBC-M納米粒子分別在680 nm (g) 和800 nm (h) 激發波長下的光聲振幅值隨納米粒子濃度變化的曲線圖. i) 紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子(i.e. 124 nm)在腫瘤部位的超聲及光聲成像.
動物實驗表明，由于實現了長循環和同源靶向之間的平衡，RBC與MCF-7膜蛋白重量比為1:1的混合膜修飾的Melanin@RBC-M復合納米粒子，相較于其它膜蛋白重量比的Melanin@RBC-M及純的黑色素納米粒子，表現出顯著增強的腫瘤部位富集和光熱治療效果：應用808 nm近紅外光照10分鐘，在較低的光功率密度下(1 W/cm2)即可完全消除腫瘤。此外，體外光聲成像結果表明，隨著黑色素核粒子尺寸的增加(64 → 148 nm)，Melanin@RBC-M復合納米粒子具有增強的光聲信號，且在680 – 800 nm 范圍的激發波長下，光聲振幅值隨納米粒子的濃度線性增加，可用于定量測定Melanin@RBC-M在體內的生物分布。
展開 肌動蛋白細胞骨架作為推動細胞爬行的分子引擎已被廣泛接受。效應T淋巴細胞的特征是強極化狀態的肌動球蛋白收縮形成細胞后部(尾足)和肌動蛋白聚合形成的細胞前部(片足)。作者首先分別利用肌動球蛋白和肌動蛋白收縮抑制劑干擾細胞。肌動蛋白聚集性抑制對細胞游泳速度影響更為明顯。表明，前方肌動蛋白聚合起主導作用是淋巴細胞游動的主要引擎。
圖3.肌動蛋白更多的是通過聚合作用推動游動而不是收縮作用
正常情況下的細胞膜運動似乎不能產生足夠的推進力，但變形蟲細胞的細胞膜表現出由內部肌動蛋白皮質逆行流動觸發的切向運動。為了證明細胞外膜的運動，作者用icam -1（一種細胞整合素配體）包被的小珠培養游泳細胞。當細胞在行進過程中遇到念珠時，念珠通過跨膜整合素LFA-1附著在細胞前端，并被向后攜帶。表明切向膜運動在游泳中起著直接作用。
圖4.向后踏膜與游泳相關
作者發現膜上附著的微珠的游動速度(νs ~ 5 μm min?1)比膜上附著的微珠的游動速度(>10 μm min?1)要小2倍。這種差異表明細胞膜和周圍液體之間的耦合不是完全的和/或膜不是均勻的。細胞質膜的組成和動力學在分子水平上確實是高度異質性的。為了闡明這一問題，作者使用了熒光特異性抗體對抗一種肌動蛋白結合蛋白，即高親和力的整合素LFA-1，和一種非肌動蛋白結合蛋白，即T淋巴細胞受體的配體，MHC-1。與肌動蛋白一樣，肌動蛋白結合蛋白LFA-1形成了持續反向流動的簇，平均速度為25±5 μm min?1。高親和力整合素與皮質下肌動蛋白的強粘附率與擴散的缺乏和速度與肌動蛋白逆行流動的相似性一致。相比之下，非肌動蛋白結合蛋白MHC-1在FRAP實驗中表現出擴散動力學以其特有的擴散系數D = 0.26±0.22μm2 s?1。
展開 G蛋白偶聯受體蛋白（GPCRs）又稱七次跨膜螺旋膜蛋白。GPCRs參與著人體的各種生理功能，包括神經信號傳遞，細胞分化，視覺，嗅覺等1-3。人類的重大疾病如老年癡呆癥，癌癥，艾滋病也與GPCRs密切相關。GPCRs是最為熱門的藥物設計和篩選靶標蛋白，目前40%左右的上市藥物都是基于GPCRs而設計4,5。因此研究和理解GPCRs的結構與功能，對當今藥物設計至關重要。
一個蛋白質的特有生理功能與活性，是由它特定的三維結構決定的。因此從蛋白三維結構來理解GPCRs的功能是當今藥物設計中必不可少的一個環節。隨著結構生物學技術突飛猛進的發展，截止到2018年7月，已經了50多個不同種類的GPCRs結構被解析出來。這其中涵蓋了GPCRs 的A,B,C和F亞家族。在這些解析的結構當中，人們發現藥物小分子可以結合在GPCRs的不同部位，這其中包括傳統的正構位點(orthosteric site)和多個別構位點(allosteric site)，諸如：膜外ECL2 loop區域，第一、二跨膜螺旋區域，第二、三跨膜螺旋區域，第三、四跨膜螺旋區域，第四、五跨膜螺旋區域、膜內G蛋白結合區域。不同的小分子結合位點所處的化學環境有所不同，這樣則給當代藥物發現與設計提供了新的機遇。
盡管傳統結構生物學對人們理解蛋白的生理功能提供了不可或缺的方法和信息，但它也有自己的缺陷。比如傳統結構生物學不能告訴人們為什么GPCRs結合激動劑(agonist)之后可以被激活，而結合拮抗劑(antagonist)的時候為什么信號通路會被阻斷。此外，單個GPCRs晶體結構也不能告訴人們GPCRs具體的激活動態過程是怎樣的。與之相比，計算結構生物學則很好的彌補了傳統結構生物學的不足6,7。比如：通過在計算機上構建磷脂雙層和溶劑模型，可以模擬GPCRs在細胞生理環境下的動態過程（圖一）。
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之前本公眾號介紹過GROMACS中膜蛋白體系的構建。按照官方的介紹，通過將磷脂構象盒力場準備好，然后在模擬盒子內進行磷脂的組裝，最后將蛋白嵌入在磷脂膜內。上述步驟雖然可以較為準確的構建模擬體系，但是并不方便調整，例如磷脂多樣性的選擇以及膜蛋白在膜內的位置和角度。本次向大家介紹一種方便的體系構建方法：利用CHARMM-GUI工具構建。
近期，加州大學舊金山分校Roybal團隊開發了一組類似于SynNotch的人源化的膜內蛋白水解受體(SNIPR)。在之前的文章中Notch核心來自于小鼠，合成轉錄因子（TF）是來源于酵母和病毒蛋白，在人源化SNIPR設計中，這些元件都換成了人源化的，將蛋白質的免疫原性降低到與目前臨床使用的 CAR 相當的水平。
Entos制藥公司使用低毒中性脂類和具有專利的融合相關小跨膜蛋白開發了一種Fusogenix蛋白-脂質載體平臺。獨特的融合相關的小跨膜蛋白可以促進蛋白-脂質載體和細胞膜的快速融合，使其裝載的貨物（例如mRNA）直接遞送到細胞質中。
肌動蛋白結合的跨膜蛋白顯示彈道向后運動，而脂質和非肌動蛋白結合的跨膜顯示擴散。這可以解釋了細胞游動速度和肌動蛋白跑步機之間的差異。
圖5.肌動蛋白結合蛋白LFA-1在細胞質膜上反向運動，而非肌動蛋白結合蛋白MHC-1在沒有凈轉運的情況下擴散
軸對稱物體表面持續的逆行流需要物質來源在前面，而匯在后面，因此這意味著存在一個內部的順行輸運來循環。
楊帆研究員專長于膜蛋白的功能與動態構象變化研究，以及基于蛋白質三維結構的生物大分子理性設計。圍繞著刺激感受的TRP通道，深入研究了低溫、高溫、辣椒素、薄荷醇以及多肽大分子等物理化學因素激活TRPV1與TRPM8通道的動態門控機制，并開發了針對TRPV1通道的具有鎮痛效果的調控分子。
如圖所示：
在膜蛋白體系的模擬中，有許多其他的小問題需要注意。例如壓力耦合的設置、原子重疊甚至系統崩潰等問題，需要針對性的進行檢查和排除。
最后，有相關需求歡迎通過公眾號聯系我們。
公眾號: 320科技工作室.
圖1: TNPs的制備及其多重免疫調控作用示意圖
研究結果提示仿生納米Treg細胞具備Treg活細胞表面的功能性膜蛋白，與單核巨噬細胞、樹突狀細胞以及激活的T細胞表面發生特異性相互作用，從而分別抑制單核巨噬細胞的破骨分化、樹突狀細胞的成熟以及T細胞的增殖與細胞因子分泌。
在自然界中，細胞或細胞器膜蛋白構象的有序轉變能夠引起膜通透性的變化，進而影響分子運輸和細胞凋亡等生命活動。然而，像生物系統那樣調控囊泡膜通透性對于合成高分子來說存在巨大挑戰。
然而，AFM可在原生環境中對分子進行成像，比如：(i)在環境溫度下；(ii)在環境壓力下；(iii)在生理緩沖中；(iv)在膜(在膜蛋白的情況下)中。此外，AFM測量機制和液體細胞的開放性，使得其可在(v)緩沖交換、(vi)溫度變化以及(vii)在圖像采集期間力的變化等場景中應用。
然后，神經遞質與突觸后膜受體蛋白的結合會刺激膜電位的變化。因此，受刺激神經纖維的局部電位分別為內部負電位和外部正電位，而相鄰神經纖維的局部電位則相反。因此，在它們之間形成電流電路。這些電流會改變鄰近神經膜的通透性，產生動作電位。這種作用反復進行，使神經沖動從一個地方轉移到另一個地方，并能在皮膚上產生觸覺。
