膜蛋白的案例
基于Gromacs進行膜蛋白體系的分子動力學模擬
今天以KALP15蛋白為例，主要介紹基于Gromacs進行膜蛋白體系的構建和模擬。
1. 蛋白結構預處理。首先通過可視化軟件（VMD、pymol等）檢查結構文件中的分子成分，去除不需要的組分。然后通過pdb2gmx命令講原始結構文件進行轉換并選擇相應力場。
2. 選擇合適的膜組分。根據自身需要選擇合適的磷脂成分（https://people.ucalgary.ca/~tieleman/download.html 可下載相關結構和力場）。并且在該步驟利用蛋白和磷脂力場構建需要的topol文件。
3. 選擇合適的蛋白和磷脂取向。由于膜蛋白的取向和在膜上的高度是固定的，因此要根據文獻報道確定合適的取向和位置。該步驟可使用trjconv和editconf等命令可以進行構象的調整。如圖所示
4. 磷脂對蛋白質的包裹。由于上個步驟中構建的體系僅僅是調整了取向，磷脂還是非常松散，因此需要將磷脂進行收縮堆積。這里參考使用了InflateGRO方法。通過genrestr命令對蛋白質進行位置限制，保證蛋白質位置不變，僅僅改變磷脂位置，讓其自身進行縮放，可縮放多次，直至達到結構的設定數值。
5. 模型構建完成之后，需要使用genion和solvate命令添加離子和水。但是此時需要注意，該步驟填充的水和離子會出現雙層膜之間，這種結構是不合理的，需要手動去除雙層膜熟睡核心的水分子。完成后結果如圖所示：
6. 隨后就可以通過grompp命令產生tpr文件并使用mdrun命令進行計算。
7. 結果分析：對于蛋白可以采用二級結構、RMSD等參數刻畫蛋白質特征，對于膜或者磷脂來說則可以通過序參數表征膜的有序程度例如有序相和無序相等。如圖所示：
也可以通過density命令分子膜的密度等特征。如圖所示：
在膜蛋白體系的模擬中，有許多其他的小問題需要注意。
展開 GROMACS復雜體系構建之利用CHARMM-GUI工具
之前本公眾號介紹過GROMACS中膜蛋白體系的構建。按照官方的介紹，通過將磷脂構象盒力場準備好，然后在模擬盒子內進行磷脂的組裝，最后將蛋白嵌入在磷脂膜內。上述步驟雖然可以較為準確的構建模擬體系，但是并不方便調整，例如磷脂多樣性的選擇以及膜蛋白在膜內的位置和角度。本次向大家介紹一種方便的體系構建方法：利用CHARMM-GUI工具構建。
首先可以打開在線網站(https://charmm-gui.org/ )，找到輸入生成選項以及膜的構建選項。這里我們可以看到可以構建純磷脂膜體系，也可以構建膜蛋白-膜復合體系。在此我們以較為復雜的膜蛋白體系為例。
通過直接輸入蛋白的PDB ID。該網站就可以幫我們搜索到需要的蛋白
蛋白選擇之后，我們還可以選擇蛋白在膜內的的旋轉角度和平移方向及距離。
點擊下一步驟之后，我們可以看到磷脂類型的選項。該工具可以非常方便的選擇不同比例的磷脂類型。在此選擇上下層膜都為50%的DOPC和50%的POPC。確定體系大小并點擊顯示體系信息之后，我們可以明確看到磷脂雙層膜的組成成分和數量。并進一步選擇體系中的離子濃度和類型。
在構建過程中，我們可以預覽體系構型，并根據實際情況進行位置和角度的調整。該工具另外一個非常方便的地方在于可以很好的產生對應的力場，不需要自己去繁瑣的改動和增加。在此我們可以選擇力場類型，模擬軟件，溫度和系綜等細節信息。
最后我們可以查看此工具生成的mdp文件、立場文件、構型等文件。確認無誤之后便可以進行類似于之前介紹過的模擬。在此需要注意，此處存在多個預平衡文件，因為膜蛋白體系比較復雜，所以需要逐漸對體系進項平衡，保持模擬穩定性。
展開 癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子增強腫瘤光熱治療效果
圖2 a) 純黑色素納米粒子和紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子的磷鎢酸負染后的透射電鏡圖, 標尺為100 nm. b) 單個乳腺癌細胞和紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子共孵育后的共聚焦成像圖, 標尺為20 μm. c) 不同RBC與MCF-7膜蛋白比重的Melanin@RBC-M納米粒子在乳腺癌細胞中的流式直方圖. d) 紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子和純黑色素納米粒子的藥代動力學曲線. e) 紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子和純黑色素納米粒子對MCF-7腫瘤的抑制生長. f) 不同尺寸Melanin@RBC-M 納米粒子的光聲信號圖譜. g-h) 不同尺寸Melanin@RBC-M納米粒子分別在680 nm (g) 和800 nm (h) 激發波長下的光聲振幅值隨納米粒子濃度變化的曲線圖. i) 紅細胞-癌細胞雜化膜包衣的黑色素納米粒子(i.e. 124 nm)在腫瘤部位的超聲及光聲成像.
動物實驗表明，由于實現了長循環和同源靶向之間的平衡，RBC與MCF-7膜蛋白重量比為1:1的混合膜修飾的Melanin@RBC-M復合納米粒子，相較于其它膜蛋白重量比的Melanin@RBC-M及純的黑色素納米粒子，表現出顯著增強的腫瘤部位富集和光熱治療效果：應用808 nm近紅外光照10分鐘，在較低的光功率密度下(1 W/cm2)即可完全消除腫瘤。此外，體外光聲成像結果表明，隨著黑色素核粒子尺寸的增加(64 → 148 nm)，Melanin@RBC-M復合納米粒子具有增強的光聲信號，且在680 – 800 nm 范圍的激發波長下，光聲振幅值隨納米粒子的濃度線性增加，可用于定量測定Melanin@RBC-M在體內的生物分布。
展開 細胞工程：免疫細胞趨化運動模式及分子機理
肌動蛋白細胞骨架作為推動細胞爬行的分子引擎已被廣泛接受。效應T淋巴細胞的特征是強極化狀態的肌動球蛋白收縮形成細胞后部(尾足)和肌動蛋白聚合形成的細胞前部(片足)。作者首先分別利用肌動球蛋白和肌動蛋白收縮抑制劑干擾細胞。肌動蛋白聚集性抑制對細胞游泳速度影響更為明顯。表明，前方肌動蛋白聚合起主導作用是淋巴細胞游動的主要引擎。
圖3.肌動蛋白更多的是通過聚合作用推動游動而不是收縮作用
正常情況下的細胞膜運動似乎不能產生足夠的推進力，但變形蟲細胞的細胞膜表現出由內部肌動蛋白皮質逆行流動觸發的切向運動。為了證明細胞外膜的運動，作者用icam -1（一種細胞整合素配體）包被的小珠培養游泳細胞。當細胞在行進過程中遇到念珠時，念珠通過跨膜整合素LFA-1附著在細胞前端，并被向后攜帶。表明切向膜運動在游泳中起著直接作用。
圖4.向后踏膜與游泳相關
作者發現膜上附著的微珠的游動速度(νs ~ 5 μm min?1)比膜上附著的微珠的游動速度(>10 μm min?1)要小2倍。這種差異表明細胞膜和周圍液體之間的耦合不是完全的和/或膜不是均勻的。細胞質膜的組成和動力學在分子水平上確實是高度異質性的。為了闡明這一問題，作者使用了熒光特異性抗體對抗一種肌動蛋白結合蛋白，即高親和力的整合素LFA-1，和一種非肌動蛋白結合蛋白，即T淋巴細胞受體的配體，MHC-1。與肌動蛋白一樣，肌動蛋白結合蛋白LFA-1形成了持續反向流動的簇，平均速度為25±5 μm min?1。高親和力整合素與皮質下肌動蛋白的強粘附率與擴散的缺乏和速度與肌動蛋白逆行流動的相似性一致。相比之下，非肌動蛋白結合蛋白MHC-1在FRAP實驗中表現出擴散動力學以其特有的擴散系數D = 0.26±0.22μm2 s?1。
展開 
發現G蛋白偶聯受體蛋白新的別構位點
G蛋白偶聯受體蛋白（GPCRs）又稱七次跨膜螺旋膜蛋白。GPCRs參與著人體的各種生理功能，包括神經信號傳遞，細胞分化，視覺，嗅覺等1-3。人類的重大疾病如老年癡呆癥，癌癥，艾滋病也與GPCRs密切相關。GPCRs是最為熱門的藥物設計和篩選靶標蛋白，目前40%左右的上市藥物都是基于GPCRs而設計4,5。因此研究和理解GPCRs的結構與功能，對當今藥物設計至關重要。
一個蛋白質的特有生理功能與活性，是由它特定的三維結構決定的。因此從蛋白三維結構來理解GPCRs的功能是當今藥物設計中必不可少的一個環節。隨著結構生物學技術突飛猛進的發展，截止到2018年7月，已經了50多個不同種類的GPCRs結構被解析出來。這其中涵蓋了GPCRs 的A,B,C和F亞家族。在這些解析的結構當中，人們發現藥物小分子可以結合在GPCRs的不同部位，這其中包括傳統的正構位點(orthosteric site)和多個別構位點(allosteric site)，諸如：膜外ECL2 loop區域，第一、二跨膜螺旋區域，第二、三跨膜螺旋區域，第三、四跨膜螺旋區域，第四、五跨膜螺旋區域、膜內G蛋白結合區域。不同的小分子結合位點所處的化學環境有所不同，這樣則給當代藥物發現與設計提供了新的機遇。
盡管傳統結構生物學對人們理解蛋白的生理功能提供了不可或缺的方法和信息，但它也有自己的缺陷。比如傳統結構生物學不能告訴人們為什么GPCRs結合激動劑(agonist)之后可以被激活，而結合拮抗劑(antagonist)的時候為什么信號通路會被阻斷。此外，單個GPCRs晶體結構也不能告訴人們GPCRs具體的激活動態過程是怎樣的。與之相比，計算結構生物學則很好的彌補了傳統結構生物學的不足6,7。比如：通過在計算機上構建磷脂雙層和溶劑模型，可以模擬GPCRs在細胞生理環境下的動態過程（圖一）。
展開 上海交大劉盡堯/陸爾奕/哈佛大學陶偉等人《Matter》：基于仿生納米調節性T細胞的免疫調控策略
受到Treg細胞這一特點的啟發，上海交通大學劉盡堯、陸爾奕和哈佛大學陶偉團隊聯合開發了基于Treg細胞膜包覆聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米顆粒（TNPs）的仿生免疫調控策略，實現了對慢性牙周炎這一免疫炎癥性疾病的有效干預（圖一）。
圖1: TNPs的制備及其多重免疫調控作用示意圖
研究結果提示仿生納米Treg細胞具備Treg活細胞表面的功能性膜蛋白，與單核巨噬細胞、樹突狀細胞以及激活的T細胞表面發生特異性相互作用，從而分別抑制單核巨噬細胞的破骨分化、樹突狀細胞的成熟以及T細胞的增殖與細胞因子分泌。另外，TNPs能顯著抑制小鼠早期和晚期牙周炎局部和引流淋巴結中的免疫激活從而有效緩解組織炎癥并減緩牙槽骨吸收。在大動物牙周炎模型中，TNPs同樣呈現顯著的炎癥抑制和組織保護作用，有效減緩了比格犬慢性牙周炎的進展（圖二）。鑒于Treg細胞在全身免疫系統的重要作用，他們認為本研究所開發的這一仿生納米Treg細胞有望作為通用的藥物遞送平臺用于多種免疫炎癥性疾病的治療。
圖2：TNPs有效緩解比格犬牙周炎進展
上海交通大學醫學院李雙博士為該論文的第一作者，劉盡堯教授、陸爾奕教授和哈佛大學陶偉教授為共同通訊作者。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.matt.2021.08.015
展開 Discovery Studio 藥物發現與生物大分子計算模擬平臺
Discovery Studio的主要模擬功能：
· 生物大分子：蛋白/核酸的序列分析、蛋白進化分析、蛋白質三維結構的預測與模擬、蛋白質結構表面電荷分析及pKa值預測、膜蛋白的結構預測與模擬、抗體的設計與分析、蛋白理性設計、丙氨酸掃描（computational alanine scanning）、核酸的設計與模擬、蛋白聚集效應預測、蛋白（核酸）-蛋白（核酸）相互作用、X-ray晶體結構解析等
· 計算化學：分子力學計算和分子動力學模擬、量子力學/分子力學（QM/MM）計算等
· 基于靶標結構藥物設計：配體-靶標相互作用（分子對接）、全新藥物設計、me too， me better藥物設計、分子對接、基于結構的虛擬篩選、基于片段的藥物設計等
· 基于配體藥物設計部分：完全基于配體的藥效團設計、基于配體-受體復合物的藥效團設計、化合物數據庫的構建和篩選、藥效團數據庫的構建與保存、定量構效關系（QSAR/QSPR）、基于MMP的SAR分析等
· 有機小分子：虛擬組合化學庫的設計與分析、類藥性篩選、化合物構象搜索和分析、化合物ADMET性質預測等
· DS的應用領域：以小分子化合物、生物大分子的設計與模擬為核心，應用領域涵蓋藥物、化學、生物三大學科，研究領域包括：疾病的發病機理研究、新藥發現和設計、生物信息學、結構生物學、酶學、免疫學、病毒學、蛋白質工程、腫瘤研究等。
· DS的易用性：DS界面友好、可定制且呈多視窗交互式，一鍵式鼠標操作、操作簡便，易于使用，且支持“服務器（Server）-客戶端（Client）”模式，使得科研人員能夠最方便且最大限度地實現計算資源共享。
· DS的可擴展性：基于領先的科學信息處理平臺Pipeline PilotTM（PP）建立起來的Discovery Studio軟件讓數據的共享和交流變得更為方便和簡潔。
展開 北鯤云講堂 | 本周四：TRP離子通道的配體門控機制&北鯤云聯合Oracle云助力生物醫學科學
楊帆研究員專長于膜蛋白的功能與動態構象變化研究，以及基于蛋白質三維結構的生物大分子理性設計。圍繞著刺激感受的TRP通道，深入研究了低溫、高溫、辣椒素、薄荷醇以及多肽大分子等物理化學因素激活TRPV1與TRPM8通道的動態門控機制，并開發了針對TRPV1通道的具有鎮痛效果的調控分子。近年來在Nature (2022)、Nature Chemical Biology (2022undefined 2015)、Science Translational Medicine (2022)、Nature Communications (2022，2020a，2020b，2020c，2019，2018，2015)、PNAS (2020，2016，2010)、Advanced Science （2021aundefined 2021bundefined 2020）、Science Advances (2017)、PloS Biology (2018) 等知名學術期刊上以通訊作者與第一作者（含共同）身份發表多篇文章。其中PNAS論文（2016， 2010）被F1000網站好評推薦；2018年PloS Biology論文成果已經入選法國中小學生教材和美國K-12教育科普教材。
黃軍寶：Oracle云Specialist，10年+云計算從業經驗，曾參與和主導國內運營商和金融集團多個云計算平臺建設和應用云化項目。
TRP離子通道的配體門控機制
熱辣的火鍋、冰爽的薄荷糖、刺激的芥末，都是我們日常生活中經常接觸到的外部化學刺激。我們人體是如何感知這些刺激的呢？在本次直播中，楊帆研究員將圍繞2021年諾貝爾生理學或醫學獎的明星分子TRP離子通道，介紹辣椒素、薄荷醇等分子是如何結合在TRP通道上，并激活這些通道的分子機制。
展開 四川大學高會樂教授課題組Biomaterials：蛋白冠對轉鐵蛋白修飾納米粒跨血腦屏障轉運以及腦腫瘤靶向性的影響
轉鐵蛋白受體（TfR）在血腦屏障（BBB）及腦腫瘤細胞上均高表達，且與轉鐵蛋白（Tf）具有較高的親和力，因而Tf常被用作靶向分子修飾納米載體以提高其腦腫瘤靶向性。然而，納米粒進入血液循環后，會迅速自發地吸附血漿蛋白，進而在其表面形成蛋白冠。蛋白冠對靶向分子的屏蔽作用極大地阻礙著靶向分子與其受體的特異性結合。受體介導的BBB跨膜轉運通常分為三部分：納米粒表面的靶向分子被細胞膜蛋白識別而介導內吞、納米粒的細胞內轉運以及納米粒的外排。然而，至今為止，多數研究均集中在蛋白冠對靶向分子與其受體的識別的影響方面，而對整個BBB轉運過程的影響知之甚少。此外，跨過BBB后的納米粒進一步靶向腦腫瘤細胞的能力也是未知。基于此，四川大學高會樂教授等人在Biomaterials上發表相關研究，探究了蛋白冠對Tf修飾納米粒跨BBB轉運及隨后的腦腫瘤靶向性的影響。
該研究從入胞、胞內轉運和出胞三方面系統性探究了體內外蛋白冠對Tf介導的腦腫瘤靶向納米粒BBB跨膜轉運效率的影響，強調了體內外蛋白冠對該轉運過程的不同影響。體外蛋白冠的形成使Tf介導的受體特異性識別能力、溶酶體逃逸能力以及跨膜轉運能力喪失；而體內蛋白冠的形成雖然保留了受體識別能力和溶酶體逃離能力，但效率有所削弱。此外，該研究還發現跨過BBB后的納米粒可進一步靶向腦腫瘤細胞。BBB跨膜轉運前后的蛋白組學分析表明，Apo A-I蛋白的存在可能有利于納米粒的BBB跨膜轉運。該研究為有效解決腦腫瘤靶向納米遞藥系統BBB跨膜轉運效率低的問題提供了參考依據，為新型腦靶向策略的提出提供了方向。
展開 蘇州大學劉莊教授課題組：細胞膜衍生的納米藥物在癌癥治療中的應用
除了具備高生物相容性以外，不同種類的細胞膜還具有不同的特性，如癌細胞膜能使納米顆粒主動靶向至同源癌細胞，血小板膜與紅細胞膜能使納米顆粒具備免疫逃避能力等；近期，還有研究者利用細胞分泌的天然納米囊泡或工程化的細胞膜納米囊泡來進行癌癥治療，本質上也是利用了生物膜的高生物相容性以及生物界面性能。由于這些特性，生物膜衍生的納米藥物在癌癥治療領域展現出巨大的應用潛力。
蘇州大學劉莊教授課題組對生物膜衍生的納米藥物在癌癥治療領域的前沿進展進行了綜述（見下圖）。該綜述重點討論了各種細胞膜包裹納米顆粒以及納米細胞膜囊泡的制備方法、生物相容性、載藥量、靶向性、療效等，小結了生物膜衍生的納米藥物在癌癥治療領域的應用潛力。雖然生物膜衍生的納米藥物在納米醫學領域取得了一些有趣的進展，但仍有諸多挑戰亟待解決：（1）用細胞膜包裹納米顆粒時，細胞膜的正確朝向難以保證；（2）在對細胞膜或納米細胞膜囊泡進行額外修飾時，可能會影響到它們的磷脂雙分子層以及膜蛋白，進而使它們失去原有的功能；（3）在用細胞膜包裹納米顆粒時，難以保證細胞膜對納米顆粒有100%的覆蓋率，使得納米顆粒仍可能被免疫系統識別并清除；（4）生物膜衍生的納米藥物的大規模工業化生產。
未來工作中，在以下幾個方面的努力將進一步推動生物膜衍生的納米藥物的發展：（1）進一步探索生物膜種類，找到具有更加獨特性質的生物膜結構來進行納米藥物的設計與制備；（2）在雜交膜包裹納米顆粒的設計中，可以嘗試更多不同種類細胞膜的組合，以應對不同的疾病；（3）在細胞膜包裹納米顆粒的操作中，可以采用專業的設備與方法，如微流控法等，提高包裹的效率與覆蓋率，保證細胞膜上功能蛋白的朝向。
展開 四川大學丁明明和譚鴻教授團隊Angew：高分子構象轉變調節囊泡膜通透性
與傳統脂質體相比，聚合物囊泡的穩定性強，化學可調節性高，但其膜通透性低，顯著阻礙了物質通過囊泡膜的運輸和交換。為了解決這個問題，研究人員通過嵌入生物大分子或引入刺激響應組分來調控膜的通透性。然而，這些方法大多數會導致囊泡崩解，或需要復雜的化學反應來維持囊泡結構。在自然界中，細胞或細胞器膜蛋白構象的有序轉變能夠引起膜通透性的變化，進而影響分子運輸和細胞凋亡等生命活動。然而，像生物系統那樣調控囊泡膜通透性對于合成高分子來說存在巨大挑戰。
近日，四川大學高分子科學與工程學院丁明明教授和譚鴻教授以“Ordered Conformation-Regulated Vesicular Membrane Permeability”為題在Angewandte Chemie International Edition上首次報道了通過聚氨基酸二級構象的有序轉變來調控聚合物囊泡膜通透性。在前期工作中，該團隊提出了利用疏水鎖和氧化門控調控聚氨基酸構象有序轉變的新方法，并通過構象驅動聚合物膠束-囊泡轉變（J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 6604-6610）。在此基礎上，研究人員通過合理設計得到了聚氨基酸囊泡，該聚合物囊泡在活性氧作用下構象由β折疊轉變為α螺旋，進而降低膜的厚度，并重構氫鍵和相行為，從而在保留囊泡完整性的同時增強其膜通透性，實現了小分子和大分子物質的特異性跨膜轉運。
研究者以膽固醇修飾的半胱氨酸為疏水段，聚乙二醇為親水段合成兩親性聚半胱氨酸（MPEG-PLCC），通過調控鏈段數得到兩親性聚氨基酸囊泡。該聚合物側鏈硫醚鍵能夠被活性氧（ROS）氧化成砜鍵或亞砜鍵，其構象由β折疊逐步轉變為α螺旋。
展開 
解決細菌耐藥性新嘗試：免疫+抗生素組合拳
此外，他們還與Lehigh大學Wonpil Im教授的團隊合作，通過計算生物物理學的方法研究抗生素與細菌膜的相互作用，建設了一個闡明免疫反應發生后細胞表面變化的模型。
Pires教授團隊過去曾經將人體可識別的抗原與D-氨基酸接合在一起。革蘭氏陽性菌合成外膜時會使用這些改裝過的、連接抗原的D-氨基酸，進而可以引發人體的免疫反應。但對于大腸桿菌和綠膿桿菌這些革蘭氏陰性菌來說就沒那么容易了。革蘭氏陰性菌的細胞膜有一層額外保護，使得他們難以被殺死，同時這些細菌也在不停進化，造成抗生素失效，讓抵抗這類細菌變得愈加困難。
例如，在2016年的全球抗生素危機中，美國發現了第一種具有MCR-1基因的大腸桿菌感染，這種基因使得大腸桿菌對colistin產生抗性，這一最后抗生素防線失效。
很多科學家都在研究如何對抗革蘭氏陰性菌的自我保護，例如一個基因泰克（Genentech）團隊也在通過免疫學的思路來解決這一問題。他們設計了一種單克 隆抗體可以特異性地與BamA（β-barrel assembly machine，β-桶蛋白組合酶）結合。BamA可以幫助革蘭氏陰性菌細胞膜β桶蛋白（β-barrel proteins）的折疊和嵌入整合。拮抗BamA則可以抑制細胞膜β桶蛋白的折疊，導致周質應激壓力，破壞外膜完整性，進而殺死細菌。基因泰克的研究結果于近期發表在《PNAS》上。
Pires博士表示：“試驗結果說明這一合成產物可以在殺死細菌的同時引發免疫反應，利用這樣的組合拳擊斃難以殺死的細菌，我們相信這樣的方法很有潛力，值得進一步開展體內研究。”
接下來，Pires博士的團隊計劃在復雜動物中進行體內研究，他們也在考慮類似基因泰克團隊的方法，即不但利用人體自由的免疫反應，同時要加入互補的外源單克 隆抗體以獲得更好的效果。
展開 mRNA納米藥物全景解讀：最新進展、挑戰，臨床轉化及未來方向
2021年8月，張鋒團隊在 Science 發表論文，開發了一種全新的RNA遞送平臺——SEND（Selective Endogenous eNcapsidation for cellular Delivery），SEND的核心是逆轉錄病毒樣蛋白PEG10，它能夠與自身的mRNA結合并在其周圍形成球型保護囊。詳情：張鋒一年前的Science論文，成功轉化出一家新公司，融資2億美元，開創mRNA遞送新方式
研究團隊使用SEND系統將CRISPR-Cas9基因編輯系統遞送到小鼠和人類細胞并成功編輯了目標基因。這將為基因治療提供一種全新的遞送載體，SEND系統是利用人類內的組分自組裝為病毒樣顆粒，與其他遞送載體相比，所引起的免疫反應更少，更具安全性。
PEG10納米顆粒
張鋒表示，SEND 技術可以補充現有的病毒遞送載體和脂質納米顆粒（LNP），以擴展向細胞遞送基因和編輯療法的工具箱。
mRNA從內體的逃逸是mRNA遞送面臨的主要挑戰，使用可電離脂質可以改善這一點，而另一種策略是直接將mRNA遞送到細胞質。Entos制藥公司使用低毒中性脂類和具有專利的融合相關小跨膜蛋白開發了一種Fusogenix蛋白-脂質載體平臺。獨特的融合相關的小跨膜蛋白可以促進蛋白-脂質載體和細胞膜的快速融合，使其裝載的貨物（例如mRNA）直接遞送到細胞質中。
Fusogenix蛋白-脂質載體
類似地，由相分離肽形成的pH-和氧化還原反應的凝聚體也能實現mRNA的直接胞質遞送和氧化還原激活的釋放，繞過了經典的內吞途徑。
除了這些新平臺，創新還將繼續生產更強大的具有多種功能的LNP，包括增強遞送能力。
展開 《Nature》重磅：超高分辨率的定位原子力顯微鏡（AFM）！
然而，AFM可在原生環境中對分子進行成像，比如：(i)在環境溫度下；(ii)在環境壓力下；(iii)在生理緩沖中；(iv)在膜(在膜蛋白的情況下)中。此外，AFM測量機制和液體細胞的開放性，使得其可在(v)緩沖交換、(vi)溫度變化以及(vii)在圖像采集期間力的變化等場景中應用。
高速AFM (HS-AFM)的另一個優點是，通過集成短懸臂梁和開發更快的掃描儀及反饋操作，可以獲得單個生物分子前所未有的實時納米地貌信息。雖然這在揭示蛋白質構象變化方面非常有效，但通常不可能解析蛋白質表面的亞分子結構特征，主要原因是AFM尖端的尺寸有限。對于通常用于成像生物樣本的探針，z方向(地形)的分辨率約為1 ?，而x、y方向的橫向分辨率約為1 nm，基本上受探針幾何形狀和探針-樣本相互作用力的限制。當對較軟的樣品成像時，由于尖端和柔性蛋白質結構之間的接觸面積增加，橫向分辨率進一步降低。由于這些限制，生物樣品的亞納米橫向分辨率僅被報道為二維(2D)晶體，并被證明是由于周期性尖端卷積效應高估。為了規避這些限制，人們提出了尖端反褶積算法，它可產生銳化的圖像，但也可能引入人工干擾。
定位顯微鏡方法，也被稱為超分辨熒光顯微鏡，如隨機光學重建顯微鏡(STORM)和光激活定位顯微鏡(PALM)，已經提供了對細胞的結構和大分子組裝的細節洞察。通過在多幅圖像中分離和定位高空間精度的激發熒光信號源，可以重建高橫向分辨率的地圖，將由光的衍射極限所設定的~400 nm分辨率限制降低到約20 nm。
在此，研究者受以上熒光定位顯微鏡方法的啟發，開發了LAFM，將定位算法應用于AFM和HS-AFM圖像中形貌特征的空間波動。與X射線結構和分子動力學(MD)模擬的比較表明，這種方法可以揭示埃米范圍內的高分辨率蛋白質表面細節。
展開 細胞治療：免疫細胞治療中基因線路設計的新進展
第二種是Synnotch 設計(圖2C)，由抗原識別結構域、Notch的跨膜核心區，合成的轉錄因子組成。近期，加州大學舊金山分校Roybal團隊開發了一組類似于SynNotch的人源化的膜內蛋白水解受體(SNIPR)。在之前的文章中Notch核心來自于小鼠，合成轉錄因子（TF）是來源于酵母和病毒蛋白，在人源化SNIPR設計中，這些元件都換成了人源化的，將蛋白質的免疫原性降低到與目前臨床使用的 CAR 相當的水平。此外，與第一代 SynNotch 相比，人源化 SNIPR 的體積更小、表達良好、具有對低水平抗原的高敏感性以及被一系列配體激活的潛力。但目前的研究僅關注 T 細胞，因此作者SNIPR設計的普遍性仍有待確定。
圖2.受體邏輯線路圖
第三種是Co-LOCKR系統(圖2D)，它的功能是通過Cage和Key這兩個銜接蛋白實現的。cage和key可以相互作用，當目標抗原存在的情況下可調節cage銜接蛋白與CAR的結合方式。每個銜接蛋白都有一個抗原結合域。其中cage蛋白含有一種能結合和激活CAR T細胞的肽。但肽的結構域被鎖存結構域隔離。當key與cage蛋白結合時，它會引起構象變化，并暴露出結合肽，從而激活CAR。且cage和key蛋白不在溶液中相互作用，僅當被抗原結合域共定位到細胞表面時，才可以激活CAR。
圖3.基于細胞狀態的細胞線路控制
此外，腫瘤微環境中也具有許多免疫抑制因子和炎癥因子，也會限制細胞的免疫功能。所以，免疫細胞可以被設計成檢測腫瘤微環境的某些特征(缺氧及低PH)，進而產生增強抗腫瘤活性。比如說針對腫瘤微環境的低氧特點，以低氧為輸入信號，來提高腫瘤靶向特異性(圖3A)。
展開 