細胞是復雜的信息處理系統，可以感知不同的環境信號，執行復雜的計算，并產生一系列廣泛的輸出，如基因表達，信號分子分泌，形態變化和細胞生長。許多細胞類型在不同環境中已經進化出生存和執行各種任務的專門能力。尤其是腫瘤治療中最重要的人體免疫細胞。嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法在血液腫瘤的成功證明了使用基因工程細胞作為治療劑的潛力，但依舊面臨許多挑戰。細胞免疫療法最關注的問題之一是由工程免疫細胞的過度活化和腫瘤外靶向引起的毒性（安全性與有效性）。而細胞療法可以通過設計復雜的基因線路，以提高其靶向特異性、安全性和有效性。

近期，波士頓大學的Ahmad S. Khali與Wilson W. Wong教授等人在cell system上發表了題為“Recent progress of gene circuit designs in immune cell therapies”的最新綜述，概述了針對臨床需求的細胞治療控制線路的設計考慮。通過對比一些最新控制電路開發中關鍵的設計特征，討論了未來細胞治療控制線路潛在的發展方向。 

雖然目前有許多不同類型的基因回路，但它們可以大致分為兩類:細胞自主控制和外源控制（圖1）。細胞自主控制基因回路依賴于來自工程免疫細胞或自然環境的信號。相比之下，外源控制基因回路依賴于來自外部試劑的信號，如小分子、光或超聲波。這兩種方法各有優劣，有不同的適用場景，自主控制的線路可以在沒有外源干預的情況下工作，但它是有不可預測性，這在臨床治療中是不能接受的，所以外源控制的線路仍然是十分重要的，它可以通過采用全身或是局部輸入，進而達到控制免疫細胞的功能。

圖1. 細胞自主控制回路與外源控制回路對比圖

在細胞自主控制的基因線路中，多抗原識別是提高腫瘤靶向性，降低脫靶毒性比較好的方法，文中重點介紹三種最先進的邏輯線路。第一種是最通用的SUPRA CAR(圖2B）,具有高度模塊化，由T細胞上表達的通用受體（zipCAR）和腫瘤靶向單鏈抗體適配器（zipFv）組成。通過改變zipFv的數量以及抗原特異性激活程度可以調節CAR激活的信號強度。但由于銜接分子（亮氨酸拉鏈）是一種蛋白質，zipFv可能對相關組織的滲透性較低，半衰期較短，并具有潛在的未知免疫反應。

第二種是Synnotch 設計(圖2C)，由抗原識別結構域、Notch的跨膜核心區，合成的轉錄因子組成。近期，加州大學舊金山分校Roybal團隊開發了一組類似于SynNotch的人源化的膜內蛋白水解受體(SNIPR)。在之前的文章中Notch核心來自于小鼠，合成轉錄因子（TF）是來源于酵母和病毒蛋白，在人源化SNIPR設計中，這些元件都換成了人源化的，將蛋白質的免疫原性降低到與目前臨床使用的 CAR 相當的水平。此外，與第一代 SynNotch 相比，人源化 SNIPR 的體積更小、表達良好、具有對低水平抗原的高敏感性以及被一系列配體激活的潛力。但目前的研究僅關注 T 細胞，因此作者SNIPR設計的普遍性仍有待確定。

圖2.受體邏輯線路圖

第三種是Co-LOCKR系統(圖2D)，它的功能是通過Cage和Key這兩個銜接蛋白實現的。cage和key可以相互作用，當目標抗原存在的情況下可調節cage銜接蛋白與CAR的結合方式。每個銜接蛋白都有一個抗原結合域。其中cage蛋白含有一種能結合和激活CAR T細胞的肽。但肽的結構域被鎖存結構域隔離。當key與cage蛋白結合時，它會引起構象變化，并暴露出結合肽，從而激活CAR。且cage和key蛋白不在溶液中相互作用，僅當被抗原結合域共定位到細胞表面時，才可以激活CAR。

圖3.基于細胞狀態的細胞線路控制

此外，腫瘤微環境中也具有許多免疫抑制因子和炎癥因子，也會限制細胞的免疫功能。所以，免疫細胞可以被設計成檢測腫瘤微環境的某些特征(缺氧及低PH)，進而產生增強抗腫瘤活性。比如說針對腫瘤微環境的低氧特點，以低氧為輸入信號，來提高腫瘤靶向特異性(圖3A)。或者以腫瘤特異性蛋白酶作為癌癥診斷和治療發展的標志物(圖3B)，通過在scFv結構域之前添加具有蛋白水解位點的掩蔽肽，在存在腫瘤特異性蛋白酶的情況下，掩蔽肽被切割，從而暴露scFv并允許抗原結合和激活CAR T細胞。還有以CAR激活為條件，進而控制局部細胞因子的產生（圖3C）。

外源控制線路的最重要目標之一是在出現不良副作用時，及時限制T細胞活性來增強安全性，或提高腫瘤靶向特異性。因此，誘導劑的藥代動力學和安全性是兩個很重要的基本參數。目前，有三類外源基因控制電路，按類型可分為：小分子、光和超聲波（圖4）。當在免疫細胞中實施時，每個系統都充當一個ON或OFF開關，由外源誘導劑來調節這種變化。然后線路就需要持續存在以保持ON或OFF狀態。因此，誘導劑的毒性和遞送方法很重要。

圖4.通過光或超聲波控制的細胞外源回路

小分子藥物門控CAR T細胞，最簡單方法是直接控制CAR的活性。在ON開關中，小分子的結合可以穩定降解物或抑制蛋白水解。在OFF開關，小分子誘導劑的存在，可將招募內源性蛋白酶水解。由于小分子的擴散效應和組織滲透性慢，相比之下，使用光感受器的基因編碼二聚體可以通過高時空分辨率的光，實現局部、無創的蛋白質相互作用。通過一種光誘導核易位和二聚化基因激活系統，實現對腫瘤殺傷的無創控制。此外由于CAR-T細胞可能攻擊目標抗原低水平表達的正常組織，研究人員用聚焦超聲波FUS觸發CAR的表達，實現對CAR的精準控制（在空間上控制CAR）,從而減少on target, off tumor的問題。

細胞自主和細胞外源控制這兩種方法不是互斥的，它們可以協同使用，將進一步增強CAR T細胞治療的整體效果。盡管這里討論的許多想法還處于早期階段，但其中一些想法比其他想法更接近臨床。目前，邏輯CAR似乎勢頭最猛。本文描述的一些藥物誘導CAR和基因開關，特別是那些使用臨床批準藥物的CAR，可以提供所需的安全控制，因此很可能在不久的將來進入臨床。

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翻譯整理/姜思琦

編輯/王巧琪

文章來源：細胞與基因線路設計