熒光標記
關注創建者：合肥國肽生物 創建時間：2018-12-21
熒光標記的實例教程
近日，南方科技大學生物醫學工程系吳長鋒教授課題組成功開發了一系列高亮度聚合物點熒光探針，通過熒光探針功能化和擴展成像技術，在普通熒光顯微鏡上可以觀察到精細的亞細胞結構，分辨率高達30 nm。相關成果發表在材料領域知名期刊Advanced Materials。
超分辨光學成像因其能夠提供低于衍射極限的分辨率而獲得了2014年諾貝爾化學獎，當前超分辨技術主要分為兩類：基于激發光調制的超分辨成像和基于單分子定位的超分辨成像。擴展顯微成像采用了截然不同的思路：通過將樣本膨脹擴大，使得原本在衍射極限范圍內的相鄰分子由于距離變大而變得清晰可辨。該方法不依賴于復雜的成像系統，用普通共聚焦顯微鏡可以獲得納米級分辨率，但樣本擴展過程中由化學猝滅及密度稀釋導致的熒光亮度衰減是該方法進一步發展的難題。
針對這一問題，研究團隊開發了適用多色擴展顯微成像的聚合物點熒光探針。相比于商用的熒光染料，聚合物點的熒光標記亮度可以提高6倍。由于聚合物點的高亮度標記，細胞骨架微管蛋白的三維空間構象、網格蛋白有被小泡以及神經元突觸結構等，都能夠在普通熒光顯微鏡上解析出來（圖1a-c）。課題組進一步將聚合物點探針、擴展成像技術、和光學漲落超分辨技術結合起來，在普通寬場顯微鏡上實現了約30 nm的超高分辨率成像，更加真實地還原出微管蛋白尺寸以及線粒體中空膜結構等細節信息（圖1d-j）。這些發現展示了高亮度聚合物點在生物光學成像的應用潛力。
圖1 三維超分辨擴展-光學漲落聯合成像解析亞細胞精細結構
擴展顯微成像的樣本標記過程步驟繁瑣、重復耗時。
展開 與之相似的，在 dSTROM 中，作者提出了光開關指紋分析，即記錄熒光分子的強度以及壽命隨著時間的變化，發現 Cy5 染料分子的距離小于 10nm 時，距離與熒光壽命同樣存在一定的單射關系。兩分子距離越近，FRET 現象越明顯，發生分子間能量轉移的可能性越大，那么 Cy5 的漂白速度就越快，熒光壽命也就越短。這一特征就像是分子定位獨一無二的“指紋”，讀取它就可以在 dSTORM 實現 10nm 以下的分辨率。
圖4：Cy5 分子不同距離下的熒光壽命（左上：18nm；右上：9nm；左下：6nm；右下：3nm）
圖源：Nat Methods 19, 986–994 (2022), Fig. 2
為了將這一探測手段真正地應用在生物學樣品上，需要更加有效以及精準的熒光標記，以實現對像個僅有幾納米的生物分子位點的特異性標記。針對這一問題，作者采用了將有機染料直接共價位點特異性的附著到感興趣的蛋白質的策略，可以實現對細胞內外蛋白質位點的特異性高效標記，誤差僅為 1 納米。利用這種特異性標記和光開關指紋分析相結合，作者觀測了質膜上的多聚體受體，并首次估計了細胞中受體亞基之間 5-7nm 的距離，還確定了標記亞基的數量。
總之，為了跨越單分子定位顯微鏡 10 納米的分辨率極限，一種光開關指紋分析方法結合特異性標記的單分子成像技術被提出，可以分辨小于 10nm 的結構。這一方法可以助力對細胞結構、細胞器和多蛋白復合物的分子組織的研究，并實現以光學方法闡明蛋白質結構。
論文信息
Helmerich, D. A. et al. Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier. Nat Methods 19, 986–994 (2022).
展開 例如，在觀察微觀紋理或納米級結構時，系統可精準捕捉熒光標記或其他對比增強信號，為后續定量分析提供可靠依據。
除了出色的成像能力，APX100還集成了高效的數據管理模塊。系統可自動整理采集數據，并保存完整的實驗參數，便于后期回溯與重復實驗。這種結構化的數據處理方式不僅提升了工作效率，也有助于團隊協作與成果共享。
來自Marlow Ingredients的Mark Taylor博士表示：“APX100在我們多樣化的實驗室環境中表現出色，不僅支撐了多個內部項目，也幫助我們拓展了合作網絡。其升級方案靈活，投資回報率高。”
APX100桌面成像系統以其簡便的操作流程、強大的成像能力和高效的數據管理功能，成為現代研發工作的理想選擇。
展開 然而，超分辨率熒光技術，包括面向光學和基于樣品擴展的技術，在定量和通量方面受到限制，尤其是在組織中熒光團的光漂白或淬滅，以及低效率或不均勻的探針傳遞。
最近，
加州理工學院
魏璐助理教授
團隊
報告了一種通用的樣本擴展振動成像策略，稱為
VISTA，用于對富含蛋白質的生物結構進行可擴展的無標記高分辨率詢問，分辨率低至 78 nm。VISTA 通過最佳保留內源性蛋白質、各向同性樣品膨脹和去除散射脂質來獲得不錯的 3D 圖像質量。沒有探針標記相關的問題，VISTA 提供無偏見
和高通量的組織研究。
通過相關的
VISTA 和免疫熒光，
團隊
進一步驗證了 VISTA 的成像特異性，并訓練了一個圖像分割模型，用于對復雜小鼠腦組織中的細胞核、血管、神經元細胞和樹突進行無標記的多分量和體積預測。
因此，VISTA 可以為多功能生物醫學研究開辟新的途徑。
相關論文以題為
Super-resolution label-free volumetric vibrational imaging
發表在《
N
ature Communciations
》上。
【主圖導讀】
圖
1：擴展和蛋白質保留樣品的高分辨率無標記振動成像。
圖
2：細胞和組織的超分辨率三維 VISTA 成像。
圖
3：在小鼠腦組織上使用熒光標記驗證 VISTA 成像特征。
圖
4：用于腦海馬組織特定和多分量成像的無標記 VISTA 預測。
展開 一般通過在芯片表面固定高密度的設計好的寡聚核苷酸或cDNA序列點陣，標記熒光探針進行核 酸雜交， 通過激光共聚焦掃描顯微鏡/CCD熒光顯微鏡等設備分析雜交熒光 信號，進而獲得核苷酸配對 序列信息。 基因芯片被廣泛應用于大規模的基因測序和基因診斷技術，讓我們能從基因層面上了解生命 活動現象。
B、疾病診斷和藥物研究 隨著微流控芯片技術的不斷發展，生物芯片技術不局限于高通量的點陣芯片， 漸漸發展成融合生物 樣本處理純化、反應標記及檢測等多個實驗步驟的功能化生物芯片，從而擴大在疾病診斷和藥物研究等 領域的應用
C、細胞分析 在生命科學領域里，對細胞組分形態變化和生命活動分析一直是研究 生命現象的重要方法。微流控 芯片類仿生空間微結構的特性為細胞培養， 單細胞捕捉等提供了非常良好的操作平臺，并使得集成化的 細胞研究成 為可能，諸如細胞進樣、培養、分選、裂解和分離檢測等過程可在一塊 芯片上完成。
D、生物分子間相互作用 生物分子間的相互作用是研究生命現象的基礎，涉及各類小分子化合物、多肽、蛋白質、寡核苷酸 和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細胞的生物體系研究。微流控芯片平臺提供了動態實時測試生物分 子間相互作用的技術，無需借助標記物進行分析，可以實時反映分子結合或解離過程中每一秒變化的情 況，能觀察兩種分子結合的特異性和強度，了解生物分子的結合過程共有多少個協同者和參與者，有助 于更真實的了解反應生命現象發生的過程。
生物微流控系統平臺集成了光學顯微鏡、生物芯片、微流體泵、微流體流速控制、電阻抗分析及用 于圖像分析的電腦等。該系統平臺能夠完成細胞滾動/粘附、細胞遷移、細胞分選、細胞運動軌跡跟蹤、 細胞數目統計分析等細胞分析及高通量細胞篩選分析。
展開 
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全電動倒置顯微鏡數字成像系統9個月前
例如，在觀察微觀紋理或納米級結構時，系統可精準捕捉熒光標記或其他對比增強信號，為后續定量分析提供可靠依據。
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納米防疫展區：納米生物與醫藥、生物傳感器，納米生物材料，靶向藥物釋放，熒光標記、納米診斷試劑、納米診斷設備、納米醫藥，納米抗菌與消毒、RNA、納米探針、人工心臟等。
納米環保清潔：光觸媒、納米抗菌消毒、HVAC系統、凈化設備、納米空氣凈化與水處理技術、空氣凈化器、空氣過濾器、水處理探測與處理設備、新型環境治理技術、PM2.5預防設備和耗材等。
目前通常采用的方法有基于粒子尺寸差異的粒徑分辨法[10]，基于粒子反射光的亮度分辨法[11]、熒光標記法[12]、中值濾波法[13]和基于尺寸、亮度差異的雙參數相分離法[14]等。
激光粒度分析儀（LPSA）用于測量霧化流場的粒徑分布，通過向噴霧場發射激光，由激光透射液霧后發生的散射強度和角度計算液滴直徑。
Helmerich，Markus Sauer 等人研究了用不同間隔距離熒光標記的 DNA 折紙，發現了熒光分子光開關動力學與間距之間的關系，并提出了將光開關指紋分析與時間分析熒光探測相結合，以跨越這一分辨率極限。
通過通用偶聯型水凝膠熒光染料（EFL-DYE-UF-ENE系列）的熒光標記，可實現多孔GelMA水凝膠內部多孔結構的直觀觀察（圖2）。
圖2 EFL-GM-PR系列多孔GleMA水凝膠可控微觀孔道結構的激光共聚焦照片
02 細胞培養
EFL-GM-PR系列多孔水凝膠在細胞培養方面具有優異的性能，通過與GelMA無孔水凝膠對比可以明顯看出多孔GelMA水凝膠的優勢。
PLA納米復合材料中觀察到的非球狀結晶形態
熒光分子標記物/高聚物體系
如圖2a1-2a4所示，iPP中加入尼羅紅(NR)熒光分子后，熒光顯微鏡下弱熒光強度的圓形區域與偏光顯微鏡下球晶結構相對應；熒光顯微鏡下球晶邊緣呈現亮環在他們前期的研究工作中已被證實是由于球晶生長時，NR分子被排除到球晶的生長前沿[Polymer 191, 122246 (2020
a，b，具有均勻分布的熒光標記的 BC-脂肪酶（a）并與偏振光學顯微鏡圖像（b）重疊的薄膜的熒光顯微鏡圖像。c，透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示 RHP-脂肪酶在半結晶球晶中的摻入。d，RHP-BC-脂肪酶摻入前后PCL的應力-應變曲線。插圖顯示了拉伸試驗之前（左）和之后（右）的 PCL-RHP-BC-脂肪酶狗骨樣品。
圖
3：在小鼠腦組織上使用熒光標記驗證 VISTA 成像特征。
圖
4：用于腦海馬組織特定和多分量成像的無標記 VISTA 預測。
針對這一問題，課題組博士后劉志賀開發了全自動細胞免疫熒光標記系統（如圖2），可以代替人工，自動完成免疫熒光標記實驗。
圖2 全自動細胞免疫熒光標記平臺
南方科技大學-香港浸會大學聯合培養博士生劉潔為本文第一作者，南方科技大學為該論文的通訊單位。
（f）激光共聚焦圖像顯示培養14天后，不同支架表面的BMSCs的RUNX2熒光標記。
圖8. 體內股骨缺損模型，研究負載BMP-2的pZIF-8/pHA-G支架體內促進骨組織修復情況。
（a）支架植入兔股骨缺損處的手術過程圖。
