由于衍射極限的存在，寬場(chǎng)顯微鏡的分辨率被限制在橫向 200nm，軸向 600nm，視野中橫向或軸向距離小于這兩個(gè)數(shù)值的兩點(diǎn)就無(wú)法被區(qū)分。為了跨越這一衍射極限，2006 年，Betzig 和莊小威等人同時(shí)且分別提出 PALM 和 STORM 兩種單分子定位成像技術(shù)。

 

單分子成像技術(shù)是現(xiàn)存最靈敏、分辨率最高的顯微成像技術(shù)之一，它使用不同種類(lèi)的特殊染料使得熒光分子的發(fā)光有一定的時(shí)序，避免了分子同時(shí)發(fā)光導(dǎo)致的相互遮蔽，因此超越了衍射極限，將分辨率提升至 ~20nm。但是，20nm 的分辨率尚不足以用于探測(cè)真正意義上的“分子”，而實(shí)現(xiàn)對(duì)尺寸在數(shù)納米的小分子的探測(cè)又對(duì)理解真實(shí)生命體中的生化反應(yīng)至關(guān)重要。

圖1：?jiǎn)畏肿佣ㄎ怀上窦夹g(shù)原理示意圖

圖源：Nat Methods 3, 793–796 (2006), Fig. 1

單從原理上看，單分子定位甚至能實(shí)現(xiàn)無(wú)限小的分辨率，影響其分辨率的可能只有噪聲帶來(lái)的定位精度下降這一因素。人們相信 20nm 遠(yuǎn)不是這一技術(shù)的分辨率極限，因此很多研究人員付出了大量的努力，不斷開(kāi)發(fā)出分辨率更高、性能更加優(yōu)越的成像系統(tǒng)。但是，這些研究不約而同地遇到了“10 納米”這一壁壘，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：

1）當(dāng)小分子間的距離為幾個(gè)納米時(shí)，熒光分子的探測(cè)率都下降嚴(yán)重，因此許多微小的結(jié)構(gòu)信息都被成像系統(tǒng)遺漏；

2）熒光分子發(fā)射光子的各向異性會(huì)引發(fā)大量的定位誤差。

這些因素都導(dǎo)致 10 納米成為單分子定位技術(shù)分辨率的“極限”。

這一極限產(chǎn)生的原因是什么呢？又是怎樣才能克服它呢？

圖2：光開(kāi)關(guān)指紋分析：光開(kāi)關(guān)循環(huán)發(fā)生率如指紋一樣獨(dú)特又如條形碼一樣成為分子距離的讀取途徑

圖源：Dr. Gerti Beliu, Rudolf Virchow Center?????????

為了研究這些問(wèn)題，來(lái)自德國(guó)維爾茨堡大學(xué)的 Dominic A. Helmerich，Markus Sauer 等人研究了用不同間隔距離熒光標(biāo)記的 DNA 折紙，發(fā)現(xiàn)了熒光分子光開(kāi)關(guān)動(dòng)力學(xué)與間距之間的關(guān)系，并提出了將光開(kāi)關(guān)指紋分析與時(shí)間分析熒光探測(cè)相結(jié)合，以跨越這一分辨率極限。

文章發(fā)表在 Nature Methods，題為“Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier”。

  10 納米分辨率極限的產(chǎn)生  

STORM 技術(shù)常用的標(biāo)記染料分子為 Cy5，這種染料在特定波長(zhǎng) λ_ON→OFF 下保持全滅狀態(tài)，在另一種波長(zhǎng) λ_OFF→ON 下可以被激活發(fā)光。那么，當(dāng)標(biāo)記片段中的兩個(gè) Cy5 分子之間距離小于10nm時(shí)，它們的激發(fā)/熄滅狀態(tài)是怎樣變化的呢？

為了研究這一問(wèn)題，作者在 DNA 折紙樣品中分別以 18，9，6，3nm 的距離標(biāo)記上 Cy5 染料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)任何一種單分子技術(shù)都無(wú)法分辨距離 10nm 以下的兩個(gè)標(biāo)記。同時(shí)，在記錄下的成像視頻中的前 1 秒內(nèi)，熒光染料會(huì) _ON→OFF 發(fā)生快速的“閃爍”。這種閃爍的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于熒光染料在不同波長(zhǎng)激光作用下發(fā)生的正常狀態(tài)切換速率。

這種速率很快的“閃爍”引起了作者的注意。Cy5 染料的光轉(zhuǎn)換循環(huán)次數(shù)是有限的，循環(huán)超過(guò)這一次數(shù)之后，染料分子就會(huì)被漂白，無(wú)法再發(fā)光了，因此導(dǎo)致了分子發(fā)光探測(cè)率下降的問(wèn)題，影響了成像質(zhì)量。這一現(xiàn)象背后的原因是什么呢？為了解釋這一現(xiàn)象，作者引入了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的概念。

FRET 是一種發(fā)生在兩個(gè)距離較近的熒光分子間的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)兩個(gè)熒光分子距離小于 10nm 時(shí)，一個(gè)分子的能量波長(zhǎng)如果在另一個(gè)分子的吸收譜范圍之內(nèi)，就可以被另一個(gè)分子吸收，從而使另一個(gè)分子也發(fā)光。輻射的能量多少與兩分子間的距離有著單射關(guān)系。對(duì)于 Cy5 染料分子來(lái)說(shuō)，熄滅狀態(tài)下的吸收譜相對(duì)較寬，因此當(dāng)激發(fā)狀態(tài)的分子和熄滅狀態(tài)的分子距離小于 10nm 時(shí)，就可以發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使得熄滅的分子再度發(fā)光。

圖3：熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理示意圖

圖源：Olympus-lifescience.com.cn

  10 納米分辨率極限的跨越  

FRET 常常借助熒光壽命這一參數(shù)實(shí)現(xiàn)成像，常用手段包括時(shí)間相關(guān)單光子技術(shù)（TCSPC）等等。與之相似的，在 dSTROM 中，作者提出了光開(kāi)關(guān)指紋分析，即記錄熒光分子的強(qiáng)度以及壽命隨著時(shí)間的變化，發(fā)現(xiàn) Cy5 染料分子的距離小于 10nm 時(shí)，距離與熒光壽命同樣存在一定的單射關(guān)系。兩分子距離越近，F(xiàn)RET 現(xiàn)象越明顯，發(fā)生分子間能量轉(zhuǎn)移的可能性越大，那么 Cy5 的漂白速度就越快，熒光壽命也就越短。這一特征就像是分子定位獨(dú)一無(wú)二的“指紋”，讀取它就可以在 dSTORM 實(shí)現(xiàn) 10nm 以下的分辨率。

圖4：Cy5 分子不同距離下的熒光壽命（左上：18nm；右上：9nm；左下：6nm；右下：3nm）

圖源：Nat Methods 19, 986–994 (2022), Fig. 2

為了將這一探測(cè)手段真正地應(yīng)用在生物學(xué)樣品上，需要更加有效以及精準(zhǔn)的熒光標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)對(duì)像個(gè)僅有幾納米的生物分子位點(diǎn)的特異性標(biāo)記。針對(duì)這一問(wèn)題，作者采用了將有機(jī)染料直接共價(jià)位點(diǎn)特異性的附著到感興趣的蛋白質(zhì)的策略，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)位點(diǎn)的特異性高效標(biāo)記，誤差僅為 1 納米。利用這種特異性標(biāo)記和光開(kāi)關(guān)指紋分析相結(jié)合，作者觀測(cè)了質(zhì)膜上的多聚體受體，并首次估計(jì)了細(xì)胞中受體亞基之間 5-7nm 的距離，還確定了標(biāo)記亞基的數(shù)量。

總之，為了跨越單分子定位顯微鏡 10 納米的分辨率極限，一種光開(kāi)關(guān)指紋分析方法結(jié)合特異性標(biāo)記的單分子成像技術(shù)被提出，可以分辨小于 10nm 的結(jié)構(gòu)。這一方法可以助力對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器和多蛋白復(fù)合物的分子組織的研究，并實(shí)現(xiàn)以光學(xué)方法闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

  論文信息  

Helmerich, D. A. et al. Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier. Nat Methods 19, 986–994 (2022).

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01548-6

文章來(lái)源：中國(guó)光學(xué)

撰稿：yvon