顯微成像的案例
顯微測量|共聚焦顯微鏡大傾角超清納米三維顯微成像
用于材料科學領域的共聚焦顯微鏡，基于光學共軛共焦原理，其超高的空間分辨率和三維成像能力，提供了全新的視角和解決方案。
工作原理
共聚焦顯微鏡通過在樣品的焦點處聚焦激光束，在樣品表面進行快速點掃描并逐層獲取不同高度處清晰焦點并重建出3D真彩圖像，從而進行分析。
儀器結構
共聚焦顯微鏡主要有四部分組成：1、顯微鏡光學系統。2、掃描裝置。3、激光光源。4、檢測系統。整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。
一體化操作的測量分析軟件
（1）測量與分析同界面操作，無須切換，測量數據自動統計，實現了快速批量測量的功能；
（2）可視化窗口，便于用戶實時觀察掃描過程；
（3）結合自定義分析模板的自動化測量功能，可自動完成多區域的測量與分析過程；
（4）幾何分析、粗糙度分析、結構分析、頻率分析、功能分析五大功能模塊齊全；
（5）一鍵分析、多文件分析，自由組合分析項保存為分析模板，批量樣品一鍵分析，并提供數據分析與統計圖表功能；
（6）可測依據ISO/ASME/EUR/GBT等標準的多達300余種2D、3D參數。
特點與應用解析
共聚焦顯微鏡最大的特點是在成像時只獲取來自樣品的一個薄層，而剩余的光信號被消除，從而消除了深度模糊現象，獲得了超高的空間分辨率。這一特性使共聚焦顯微鏡對大坡度的產品有更好的成像效果，一般用于略粗糙度的工件表面的微觀形貌檢測，分析粗糙度、凹坑瑕疵、溝槽等參數。
展開 用于高NA顯微鏡成像的工程化PSF
顯微成像技術在最近的幾十年中得到迅速發展。 PSF（點擴散函數）通常不是像平面上的艾里斑。當對沿縱軸定向的偶極子源進行成像時，可以設計出一個甜甜圈形狀。 我們在VirtualLab Fusion中證明，當偶極子源的方向發生變化時，會獲得不同的非對稱PSF（不是艾里斑）。 此外，可通過在顯微鏡系統的光瞳平面中插入一定的相位掩模來獲得雙螺旋PSF [Ginni Grover et al., Opt. Exp. 2012]。通過這種工程化的PSF，甚至可以觀察到物體的微小散焦，即與傳統的成像方法相比，可以大大提高軸向分辨率。 我們通過在VirtualLab Fusion中應用商業顯微鏡鏡頭（Nikon）系統來演示此現象。
使用高NA顯微鏡系統分析偶極子源的PSF
在VirtualLab Fusion中，可以直接分析偶極子源的PSF。 該實驗證明了當偶極子源的方向改變時，PSF具有不同的形狀。
用于3D成像顯微鏡的雙螺旋PSF
在VirtualLab Fusion中，通過在高NA顯微鏡系統的光瞳平面中插入相位掩模，以簡單快捷的方式分析雙螺旋PSF。 結果表明，即使只有一點散焦（?130 nm）的物點，雙螺旋PSF也會有旋轉。
展開 用于高NA顯微鏡成像的工程化PSF
顯微成像技術在最近的幾十年中得到迅速發展。 PSF（點擴散函數）通常不是像平面上的艾里斑。當對沿縱軸定向的偶極子源進行成像時，可以設計出一個甜甜圈形狀。 我們在VirtualLab Fusion中證明，當偶極子源的方向發生變化時，會獲得不同的非對稱PSF（不是艾里斑）。 此外，可通過在顯微鏡系統的光瞳平面中插入一定的相位掩模來獲得雙螺旋PSF [Ginni Grover et al., Opt. Exp. 2012]。通過這種工程化的PSF，甚至可以觀察到物體的微小散焦，即與傳統的成像方法相比，可以大大提高軸向分辨率。 我們通過在VirtualLab Fusion中應用商業顯微鏡鏡頭（Nikon）系統來演示此現象。
使用高NA顯微鏡系統分析偶極子源的PSF
在VirtualLab Fusion中，可以直接分析偶極子源的PSF。 該實驗證明了當偶極子源的方向改變時，PSF具有不同的形狀。
用于3D成像顯微鏡的雙螺旋PSF
在VirtualLab Fusion中，通過在高NA顯微鏡系統的光瞳平面中插入相位掩模，以簡單快捷的方式分析雙螺旋PSF。 結果表明，即使只有一點散焦（?130 nm）的物點，雙螺旋PSF也會有旋轉。
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展開 用于高NA顯微鏡成像的工程化PSF
顯微成像技術在最近的幾十年中得到迅速發展。 PSF（點擴散函數）通常不是像平面上的艾里斑。當對沿縱軸定向的偶極子源進行成像時，可以設計出一個甜甜圈形狀。 我們在VirtualLab Fusion中證明，當偶極子源的方向發生變化時，會獲得不同的非對稱PSF（不是艾里斑）。 此外，可通過在顯微鏡系統的光瞳平面中插入一定的相位掩模來獲得雙螺旋PSF [Ginni Grover et al., Opt. Exp. 2012]。通過這種工程化的PSF，甚至可以觀察到物體的微小散焦，即與傳統的成像方法相比，可以大大提高軸向分辨率。 我們通過在VirtualLab Fusion中應用商業顯微鏡鏡頭（Nikon）系統來演示此現象。
使用高NA顯微鏡系統分析偶極子源的PSF
在VirtualLab Fusion中，可以直接分析偶極子源的PSF。 該實驗證明了當偶極子源的方向改變時，PSF具有不同的形狀。
用于3D成像顯微鏡的雙螺旋PSF
在VirtualLab Fusion中，通過在高NA顯微鏡系統的光瞳平面中插入相位掩模，以簡單快捷的方式分析雙螺旋PSF。 結果表明，即使只有一點散焦（?130 nm）的物點，雙螺旋PSF也會有旋轉。
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共聚焦顯微鏡：成像原理、功能、分辨率與優勢解析
共聚焦顯微鏡作為一種高精度的成像技術，為這些領域提供了強大的工具。
共聚焦顯微鏡成像原理
共聚焦顯微鏡的成像原理基于激光掃描和光學切片技術。通過使用光源，顯微鏡能夠對樣品進行逐點掃描，并通過共軛孔徑系統排除非焦平面的光，從而實現高分辨率的二維圖像。此外，通過逐層掃描，共聚焦顯微鏡還能夠構建樣品的三維形貌。
功能介紹
共聚焦顯微鏡在材料測量領域的主要功能包括：
1、表面粗糙度分析：測量材料表面的微觀結構和粗糙度。
2、層厚和深度測量：對多層材料系統中各層的厚度進行精確測量。
3、缺陷檢測：識別材料中的微觀缺陷，如裂紋、孔洞等。
4、三維形貌重建：構建材料表面的三維圖像，為材料特性分析提供更多維度的信息。
分辨率
共聚焦顯微鏡的分辨率是其核心優勢之一。橫向分辨率可達到亞微米級別，而軸向分辨率則更高，通常在納米級別。這種高分辨率使得共聚焦顯微鏡能夠捕捉到材料表面的微小變化和細節，清晰地展示微小物體的圖像形態細節，顯示出精細的細節圖像。它更擅長微納級粗糙輪廓的檢測。
優勢
1. 高精度測量：提供微米甚至納米級別的測量精度，滿足精密測量的需求。
2. 無損檢測：允許在不損傷樣品的情況下進行測量，適用于貴重或敏感材料。
3. 多尺度分析：能夠同時觀察材料的宏觀和微觀結構，提供全面的分析視角。
4. 實時成像：快速獲取材料表面的實時圖像，便于動態分析和過程監控。
5. 軟件支持：配備專業軟件，便于數據的采集、處理和分析，提高工作效率。
展開 前沿進展 | 多焦點光場顯微成像技術
在過去的幾十年里，研究者們開發了多種快速、高質量的體成像方法，其中光場顯微成像技術（light-field microscopy, LFM）由于其高并行性和低光毒性受到研究者的青睞。通過在光路中加入微透鏡陣列（microlens array, MLA），LFM可以在單次拍攝中對三維空間內的高維光信息進行編碼。通過配套的反解算法，可以以高保真度還原場景的三維信息。然而，LFM的分辨率與體覆蓋率相互制約，重建三維體的分辨率隨著離焦距離的增大而快速下降，這阻礙了LFM在大范圍活體場景下的應用。為了突破這一限制，研究者們提出了一些方法，包括使用雙聚焦微透鏡陣列[1]或者采用共聚焦光場顯微系統[2]等等，但是這些方法增加了系統的復雜性。如何低成本地擴大光場成像的高分辨率范圍仍是一個充滿吸引力的課題。
論文導讀
近日，來自清華大學腦與認知科學研究院、自動化系的研究團隊提出了一種多焦點同步采集的球差輔助掃描光場成像方法(Spherical-Aberration-assisted scanning LFM, SAsLFM)。在先前提出的掃描光場技術的基礎上[3,4]，研究人員利用折射率不匹配引入球差相位調制，對不同子孔徑分量焦點的空間位置進行再分配，從而實現同步多焦點體數據采集。通過相空間分塊融合的重建算法，可以從SAsLFM采集所得的高維光場數據中抽離出不同深度的高分辨信息并進行匹配融合，以此還原大尺度高分辨的三維體信息。
展開 多模式硬X射線顯微成像：超高分辨率（近10 納米）和其在材料科學研究中的應用
特別對與掃描顯微成像，并行多模式的成像方式使得不同的信息的空間分布可以同時獲得，因此在很多科學領域具有極大的應用需求。 由于聚焦硬X射線非常困難， 提高其空間分辨率一直是一個巨大的挑戰。特別是到10 納米量級，基本接近現有光學器件的衍射極限。
【成果簡介】
近日，美國布魯克海文國家實驗室國家先進光源II（NSLS-II）的嚴函斐博士（第一作者，通訊作者）及同事，康涅狄格大學Wilson Chiu教授以及克萊門大學Kyle Brinkman教授合作，報道了利用一種特殊的多層膜勞埃鏡（MLL）聚焦硬X射線接近衍射極限，并用不同的方法確認了近10納米的掃描成像分辨率。采用重疊關聯衍射成像中的迭代相位恢復算法（ptychography），分辨率可以進一步提高到10納米以下。利用納米小光斑和光柵掃描，這個小組研究了一種離子電子混合導電膜（廣泛應用于燃料電池和氣體分離技術）并得到了這種材料的在極高分辨率上的熒光，吸收，微分相位和相位圖。前者給出元素分布，后三者給出電子密度，結構和形貌分布。在納米尺度上，觀察到了一個新生成的材料相。這是硬X射線掃描顯微學在近10納米分辨率上的第一個科學應用，并宣告進入10納米時代。相關成果以題為“Multimodal hard x-ray imaging with resolution approaching 10nm for studies in material science” 發表于IOP頂級期刊Nano Futures上。
【圖文導圖】
圖1 硬X位于美國布魯克海文國家實驗室國家先進光源II的硬X射線掃描站（HXN）示意圖
NSLS-II是美國近年建造的第三代同步輻射光源，以提供高空間分辨率和高能量分辨率的巨大需求。其中HXN提供世界領先的空間分辨能力。整個束線可以認為是一個120米長的超級X射線掃描顯微鏡。
展開 全電動倒置顯微鏡數字成像系統
在當前材料科學與精密制造研究中，高精度成像技術已成為推動項目進展的關鍵工具。APX100全電動倒置顯微鏡數字成像系統以其卓越性能和智能化設計，為研究人員提供了一套高效、便捷且圖像質量優異的解決方案，助力將更多時間投入到核心分析任務中。
全電動倒置顯微鏡：https://lifescience.evidentscientific.com.cn
產品連接：https://lifescience.evidentscientific.com.cn/zh/solutions-based-systems/apx100/
APX100基于先進的光學平臺，結合直觀的操作界面與人工智能算法，實現了從樣品定位到圖像采集的全流程自動化。系統配備智能樣品導航器和快速自動對焦功能，顯著減少傳統手動操作所需的時間，使研究人員能夠更專注于數據獲取與分析。此外，APX100支持多通道、拼接、延時及Z堆棧等多種成像模式，滿足表面結構、涂層材料、復合元件等多樣化檢測需求。
在圖像質量方面，APX100采用了與成像系統相同的優質光學元件，確保輸出圖像具備高清晰度與細節還原能力。例如，在觀察微觀紋理或納米級結構時，系統可精準捕捉熒光標記或其他對比增強信號，為后續定量分析提供可靠依據。
除了出色的成像能力，APX100還集成了高效的數據管理模塊。系統可自動整理采集數據，并保存完整的實驗參數，便于后期回溯與重復實驗。這種結構化的數據處理方式不僅提升了工作效率，也有助于團隊協作與成果共享。
來自Marlow Ingredients的Mark Taylor博士表示：“APX100在我們多樣化的實驗室環境中表現出色，不僅支撐了多個內部項目，也幫助我們拓展了合作網絡。其升級方案靈活，投資回報率高。”
展開 用于革命性成像的高數值孔徑顯微鏡
高分辨顯微鏡離軸成像分析
VirtualLab Fusion是一款光學建模和設計軟件，為光學工程師提供了一套綜合的可互操作仿真算法，并將其整合到一個平臺上。這使工程師能夠徹底探索光學系統，如這些強大的高NA顯微鏡，包括所有相關的影響，并為他們提供全面探究的必要工具。
高數值孔徑(NA)顯微鏡以前所未有的清晰度和精度徹底改變了我們探測生物結構的能力。通過利用光學原理，具有數值孔徑的顯微鏡超越了傳統限制，在捕捉復雜的細胞結構，動態分子相互作用和微妙的納米級現象方面表現出色。無論是揭開細胞動力學的奧秘還是深入研究納米材料的復雜性，高NA顯微鏡使科學家能夠在微觀世界中推動探索和發現的界限。
展開 [NEWSLETTER] 用于革命性成像的高數值孔徑顯微鏡
高數值孔徑(NA)顯微鏡以前所未有的清晰度和精度徹底改變了我們探測生物結構的能力。通過利用光學原理，具有數值孔徑的顯微鏡超越了傳統限制，在捕捉復雜的細胞結構，動態分子相互作用和微妙的納米級現象方面表現出色。無論是揭開細胞動力學的奧秘還是深入研究納米材料的復雜性，高NA顯微鏡使科學家能夠在微觀世界中推動探索和發現的界限。
VirtualLab Fusion是一款光學建模和設計軟件，為光學工程師提供了一套綜合的可互操作仿真算法，并將其整合到一個平臺上。這使工程師能夠徹底探索光學系統，如這些強大的高NA顯微鏡，包括所有相關的影響，并為他們提供全面探究的必要工具。
高分辨顯微鏡離軸成像分析
本用例演示了具有不同橫向移動距離的離軸目標點的成像，以探究像差對PSF的影響。
具有很高數值孔徑的反射顯微鏡系統
本用例演示了使用VirtualLab Fusion的快速物理光學技術對具有0.99高數值孔徑的緊湊型反射顯微鏡系統的建模。進一步將結果與參考文獻進行比較。
展開 Light | 復消色差X射線聚焦
a）3D打印的發散型CRL置于250納米厚的氮化硅膜上的光學顯微鏡圖像；b）復合折射透鏡和c）45度視角的波帶片的掃描電子顯微鏡圖像；d）復合折射透鏡（左下角）與火柴棒的對比。
在德國PETRA III同步輻射P06光束線上進行的X射線掃描透射顯微成像和疊層成像測量結果顯示，該透鏡系統在7至12 keV的X射線能量范圍內表現出極佳的消色差性能，見圖3。
圖3：Siemens星測試樣品在不同能量X射線束中的掃描透射顯微圖像 (樣品在光軸上位置無變化)。圖中展示了兩個不同的FZP-CRL分離距離d。
相比前述報道的初代X射線消色差透鏡，復消色差透鏡的有效能量范圍提高了四倍。該系統的實現對短曝光時間和高信噪比的時間分辨實驗有重要意義。
該系統亞微米尺寸的焦點可分辨480 nm線寬的測試樣品。納米3D打印技術的發展使數值孔徑更高的光學元件的制備并不困難，可以進一步提高其空間分辨率。但由于折射透鏡對X射線的吸收，實現100納米以內的高分辨率仍然頗具挑戰。在硬X射線波段，相對較低的X射線吸收可以帶來更大的改進空間。納米級3D打印技術的快速發展將是實現所需折射結構制造的關鍵。
X射線消色差和復消色差透鏡的問世，是X射線顯微成像領域具有里程碑意義的重大進展，甚至有可能以其經濟、緊湊和同軸成像的優勢取代現有的反射鏡系統，將在基于加速器和實驗室X射線源的顯微成像系統中扮演越來越重要的角色。
論文信息
Sanli, U.T., Rodgers, G., Zdora, MC. et al. Apochromatic X-ray focusing. Light Sci Appl 12, 107 (2023).
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.: AIE材料用于STED超分辨生物成像
【背景介紹】
熒光顯微成像技術因其高分辨力和低侵入性，已成為生物醫學研究和診療中重要的觀測手段。但是，由于光學衍射極限的存在，傳統的光學顯微術的分辨能力在200 nm左右，無法滿足亞細胞尺度的觀測需求，而超分辨顯微技術則打破了技術瓶頸，實現了超越光學衍射極限的分辨能力。STED超分辨顯微術的發明者Stefan Hell因這項技術與PALM超分辨顯微術的發明者共同獲得了2014年諾貝爾化學獎，STED顯微術也因其極高的分辨能力而受到廣泛關注。
STED超分辨技術的基本原理如下：一束符合光學衍射極限的激光作為激發光，把熒光探針的電子激發到激發態；另一束激光作為擦除光，其光斑經過調制，中心能量很低，形成類似“甜甜圈”的光斑，被激發光激發后的熒光探針在被擦除光照射后，將發生與擦除光波長相同的受激輻射，只有處于擦除光中心沒有能量的部分會發射熒光。如此一來，發射熒光的半徑是由“甜甜圈”的中心半徑決定的，而不是激發光的半徑決定的，即小于衍射極限半徑。
但是，STED顯微成像對熒光探針的要求極為苛刻，首先，熒光材料需要具備很高的受激輻射效率，這樣一來才能獲得較好的“擦除”效果；其次，熒光材料需要極高的光穩定性，因為一般來說擦除光都是功率很高的激光，如果熒光探針容易被光漂白就無法實現STED成像；除此之外，熒光材料還需要具備較大的斯托克斯頻移，否則如果擦除光能被熒光材料吸收并發射熒光，會極大地影響成像效果。目前上轉換材料、量子點和一些有機染料都被用于STED，但是上轉換材料的熒光壽命太長，使得成像速度很慢，難以實現對生命過程的實時觀察；量子點普遍斯托克斯頻移很小，使得成像效果不盡如人意；傳統的有機染料雖然生物兼容性最好，且靶向性強，但是普遍斯托克斯頻移不大，并且光穩定性不好，難以實現長時間的觀測。
展開 ：開發高亮度聚合物點探針實現三維多色超分辨成像應用
近日，南方科技大學生物醫學工程系吳長鋒教授課題組成功開發了一系列高亮度聚合物點熒光探針，通過熒光探針功能化和擴展成像技術，在普通熒光顯微鏡上可以觀察到精細的亞細胞結構，分辨率高達30 nm。相關成果發表在材料領域知名期刊Advanced Materials。
超分辨光學成像因其能夠提供低于衍射極限的分辨率而獲得了2014年諾貝爾化學獎，當前超分辨技術主要分為兩類：基于激發光調制的超分辨成像和基于單分子定位的超分辨成像。擴展顯微成像采用了截然不同的思路：通過將樣本膨脹擴大，使得原本在衍射極限范圍內的相鄰分子由于距離變大而變得清晰可辨。該方法不依賴于復雜的成像系統，用普通共聚焦顯微鏡可以獲得納米級分辨率，但樣本擴展過程中由化學猝滅及密度稀釋導致的熒光亮度衰減是該方法進一步發展的難題。
針對這一問題，研究團隊開發了適用多色擴展顯微成像的聚合物點熒光探針。相比于商用的熒光染料，聚合物點的熒光標記亮度可以提高6倍。由于聚合物點的高亮度標記，細胞骨架微管蛋白的三維空間構象、網格蛋白有被小泡以及神經元突觸結構等，都能夠在普通熒光顯微鏡上解析出來（圖1a-c）。課題組進一步將聚合物點探針、擴展成像技術、和光學漲落超分辨技術結合起來，在普通寬場顯微鏡上實現了約30 nm的超高分辨率成像，更加真實地還原出微管蛋白尺寸以及線粒體中空膜結構等細節信息（圖1d-j）。這些發現展示了高亮度聚合物點在生物光學成像的應用潛力。
圖1 三維超分辨擴展-光學漲落聯合成像解析亞細胞精細結構
擴展顯微成像的樣本標記過程步驟繁瑣、重復耗時。
展開 原位納米力學測試系統——材料微觀力學性能
原位：對材料進行力學性能測試中，通過掃描電子顯微鏡等儀器對載荷作用下材料變形損傷進行全程動態監測的一種力學測試新技術。（原位納米力學測試系統）原位測試儀器：在顯微成像設備的腔體內進行試驗材料拉伸/壓縮力學性能測試的系統；（原位納米力學測試系統）獲得彈性模量、屈服極限及破壞極限等重要力學參數；并結合顯微成像設備的圖像記錄功能材料的損傷變形、裂紋產生等力學行為分析。 （原位納米力學測試系統）離位測試：試驗機對材料試作進行拉伸試樣；由試驗機繪出載荷-伸長曲線，進而得到載荷作用下應力應變曲線圖；拿經過拉伸試驗的試件去掃描電鏡進行放大觀察分析，（原位納米力學測試系統）電鏡將試件放大到5000倍觀察即是微觀級別，放大到10000倍是納米級別。
納米力學主要研究納米尺度物質的力學性質和動力學問題，有非常廣泛和重要的科研和應用價值。傳統的力學系統通常由牛頓力學描述，（原位納米力學測試系統）而納米力學可以實現傳統力學體系無法實現的功能和動力學特性，近年來受到了廣泛的關注。產生超強非線性效應和非對稱的振動傳播，（原位納米力學測試系統）對未來該領域的基礎和應用研究起到了重要推動作用。 眾所周知，胡克定律是支配力學系統的重要規律，其可以表述為對于微小的形變，力學系統的響應是線性的。（原位納米力學測試系統）納米力學的一個最重要的研究目標就是產生強非線性效應，之前已經有大量的研究工作，利用諸如光-力相互作用、低維力學材料、超導電路等不同手段，（原位納米力學測試系統）在納米力學系統中產生了較為顯著的非線性效應。然而，其中標志強非線性的主要現象——熱非線性區，尚未實現。 本篇文章出自北京歐倍爾，轉載請注明出處。
展開 用于3D成像顯微鏡的雙螺旋PSF
摘要
雙螺旋(DH) PSF工程在縱向上為三維成像提供了高分辨率，它可以通過在光瞳平面上增加一個帶有漩渦的相位掩膜來產生[Ginni Grover等，Opt. Exp. 2012]。VirtualLab Fusion提供了一種快速方便的方法來計算高NA顯微鏡系統小離焦的DH PSFs。這個用例說明了DH-PSFs在離焦約130nm時有明顯的變化。
建模任務
在VirtualLab Fusion中構建系統
系統構建塊
元件解算器
利用光線追跡進行幾何光學仿真
結果：幾何光線追跡
利用場追跡進行物理光學仿真
不同離焦像面的雙螺旋PSF
文件信息
延伸閱讀
- Debye-Wolf積分計算器
- 分析高NA物鏡
- 用瑞利判據研究顯微鏡物鏡的分辨率
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