生物墨水
關注創建者：匿名 創建時間：2021-12-09
生物墨水的實例教程
研究者使用海藻酸鈉和GelMA作為墨水的前驅體發現，擠出打印所需的流變特性依賴于微凝膠的緊密堆積狀態，而與微凝膠和第二網絡的組成無關。
圖2 MB生物墨水的流變性及組成的多樣性
接下來研究者研究了MB生物墨水的可打印性，發現由于阻力較小，微凝膠被間隙水凝膠前體均勻擠出，通過405nm燈后交聯進一步穩定，相鄰層間有良好的互聯性。并且該生物墨水能夠打印出各種復雜的人體器官仿生結構。（圖3）
圖3 使用MB生物墨水的3D打印能力和保真度
然后研究者比較了不同墨水的力學性能，與GelMA本體水凝膠相比，MB生物墨水和JM生物墨水表現出更大的彈性，此外，對于MB生物墨水來說，微凝膠在壓縮條件下被進一步限制在第二個網絡內，因此與JM生物墨水相比具有相對較高的彈性模量。MB生物墨水具有非凡的結構穩健性和循環性能。（圖4）
圖4 MB生物油墨打印結構的力學表征
研究者將HepG2和HUVEC分別封裝在MB生物墨水的微凝膠和水凝膠前體中打印肝組織。發現HUVEC主要存在于MB生物墨水組的微凝膠間區域。與純水凝膠生物墨水相比，MB生物墨水組的HUVEC在第3和第7天表現出更高的增殖率，且形態延長，通過內皮細胞組裝形成隨機的管狀血管結構，覆蓋在HepG2微凝膠表面。MB生物墨水中有一個相對成熟的肝細胞基因和蛋白表達譜，能夠增強肝功能和肝臟特異性基因和蛋白的表達。
展開 自3D 生物打印首次被報道后，該領域得到迅速發展。相較于傳統的組織工程，3D生物打印具有能夠制造特定結構的優勢，是有望能轉化進入臨床應用的生物制造方法。然而截至目前很少有真正進入臨床試驗的研究，究其原因在于研究3D生物打印的科學家和臨床醫生所關注的點不同，導致無法實現標準統一。如何跨越這道鴻溝，步入臨床應用的通途是3D生物打印領域接下來面臨的挑戰。作為生物打印的主體，生物墨水的角色尤其重要。3D生物打印的臨床轉化與新一代的生物墨水的開發密不可分。對此，弗萊堡大學高分子研究所的Shastrilab對目前3D生物打印技術（擠壓成型式）進行了總結并提出生物墨水開發的五個階段（TRL1-5），生物墨水需要具備的特性和標準化的工具，以期對未來研究3D生物打印的研究者提供一些參考（圖1）。
圖1 生物墨水開發的五個階段以及各階段涉及到的標準化工具
此前有學者將生物墨水定義為“能夠適用于自動化制造和成型的包含細胞的配方，可包含生物活性成分和生物材料”。這一定義強調了細胞在生物墨水中的重要性。然而在真實的打印中，生物材料本身的作用不可忽視。在構建復雜結構的例子中，細胞的打印幾乎離不開生物材料的支撐。生物材料不僅扮演了傳遞細胞的作用，其本身對細胞和其他生物活性物質的影響更是不容小覷。早在本世紀初年就有學者提出生物材料的指引作用，其給內含細胞提供了機械力、物理、化學和生物信號。因此本文將生物墨水中的介質（生物材料）比喻為空白的畫布，通過后期的控制和改性具有特定的生物學功能和理化特性，比如引入特殊的基團控制其交聯機制，調控內部原有基團的比例而操控硬度，或者接枝生物小分子使其具備特定的生物功能。
展開 骨組織工程(BTE)是材料科學和生物工程領域的一個新興領域，研究人員致力于設計一種理想的仿生材料，優化當前的骨骼輔助修復手段。盡管目前還沒有實驗成果能從實驗臺上轉移到臨床領域，但在結合了各類尖端技術的研究中，已經出現不少令業內人士興奮的新方法。從實驗室的生物制造過程來看，細胞、蛋白質、生物成分和生物材料的相互作用，可以實現工業化規模的再生醫學材料制造。
傷筋動骨還要一百天？3D打印新生物材料有助于骨骼修復再生
德累斯頓大學(TU Dresden)醫學院轉化骨、關節和軟組織研究中心(Centre for Translational Bone，簡稱CBT)的研究人員在《生物制造》(Biofabrication)雜志上撰文指出，他們研發了一種磷酸鈣接合劑配方，通過將活的生物細胞封裝在3D打印BTE材料的生物墨水中，建立類似于基質的支架。研究人員最初提出的制造方案，主要方向是為細胞在糊狀磷酸鈣骨接合劑(CPC)中存活提供最佳條件，隨后，他們又提出了一種用于骨發育和軟骨發育的軟骨組織移植模型。
制造仿生材料是高度復雜的工程，細胞和細胞外基質復雜的特性，使其天然難以使用現有技術再現。因此，組織工程的主要目標是，開發功能相似的結構和類似于組織或器官的生物/化學成分。由于生物礦化材料更適合設計骨骼模擬基質，格林斯基(Gelinsky)和他的同事們使用了一種多通道3D打印技術，將自定CPC與間充質干細胞生物墨水結合起來。這種含有人類細胞的生物墨水是用海藻酸酯甲基纖維素(alg/mc)混合制成的，由同組研究人員早前研發。
總的來說，新型生物材料包括可標繪CPC、載有細胞的生物墨水和納米晶羥基磷灰石(HAp)，在3D打印生物支架生物淋溶器中通過多通道擠壓，制成高剛度、骨狀礦物結構的支架以支持細胞生長。
展開 現有生物打印組織的一個顯著缺點是由于制造和儲存的復雜性而難以廣泛應用。近日，哈佛大學醫學院Y. Shrike Zhang教授課題組報道了一種獨特的冷凍生物打印策略，通過結合擠出式生物打印和冷凍保存，同時制備和冷凍保存負載細胞的組織結構。通過使用具有精確可控溫度的冷凍板設計以及冷凍保護生物墨水的優化，來研究冷凍生物打印的可行性和有效性（圖 1）。有意思的是，原位冷凍過程進一步提高了載有細胞的水凝膠生物墨水的可打印性，以實現打印自由形式的結構。研究進一步評估了生物墨水不同成分在低溫冷凍生物打印環境下對細胞活性的影響，而功能性最終通過細胞分化和雞胚離體實驗進行了驗證。該方法將對生物打印組織結構的儲存和運輸產生深遠影響，使得其將來的應用轉化性得以顯著提高。
圖1 用于同時制備和冷凍保存的冷凍生物打印示意圖。
該文章以“Freeform Cell-Laden Cryobioprinting for Shelf-Ready Tissue Fabrication and Storage”為題發表在《Matter》上。哈佛大學醫學院、McGill大學聯合培養博士Hossein Ravanbakhsh，哈佛大學醫學院、四川大學華西臨床醫學院聯合培養博士羅澤宇，哈佛大學醫學院、鄭州大學訪問學者張響為論文的共同第一作者，通訊作者為哈佛大學醫學院Y. Shrike Zhang教授。
展開 基于擠出的生物打印是一種新興的3D打印技術，適合制造細胞裝載的特殊結構。“生物墨水”影響著打印可行性、結構穩定性，以及打印后細胞的活力。通常，水凝膠是細胞封裝和培養的理想材料，研究人員已經開發了多種通過擠出成形或光照形成水凝膠的生物墨水材料，例如膠原蛋白、海藻酸鹽、明膠甲基丙烯酰(GelMA)、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)等。
其中，基于 GelMA 的生物打印材料在再生醫學領域表現得更良好，它具有易于處理、免疫原性低、成本低廉等優點。此外，作為一種基于明膠的水凝膠，GelMA包含肽可裂解的序列，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD) 和基質金屬肽酶 (MMP)基序，這對細胞粘附、遷移和生長來說至關重要。
然而，GelMA在交聯機制方面卻有著明顯的缺陷，因為它通過自由基介導的鏈增長聚合進行光交聯，容易受到氧抑制并導致活性氧(ROS)積累，這對裝載的細胞或蛋白來說是不利的，非常容易造成細胞的死亡或蛋白功能的喪失。相較于此，硫醇-烯化學的簡單高效、對環境氧氣不敏感，并且其逐步增長聚合的過程中會消耗ROS，從而保留了細胞和蛋白質的生物活性。
因此，本文作者以明膠-降冰片烯(GelNB)為生物墨水基質，以硫醇化肝素(HepSH)為交聯劑，擠出后在光照條件下(365 nm)通過快速的逐步聚合制備了適合細胞負載的GelNB/HepSH水凝膠(圖1)。
圖1. 分別利用
GelMA 和
GelNB/HepSH 生物墨水進行細胞負載生物打印的示意圖。
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《Biomaterials》：脫細胞基質墨水的無掃描連續光固化生物3D打印（2018）
該研究提出了一種利用光交聯的dECM生物墨水和投影式光固化生物3D打印技術的微尺度仿生組織制造新方法。
考慮到這項技術的未來，Gupta 博士表示：“生物墨水和基質正變得越來越普遍。并且可以誘導細胞在包括干細胞在內的生物基質中生長。因此，在不久的將來，器官也可以打印出來，極大地促進了醫學界的發展。器官移植的漫長等待時間將很快成為過去。” 南極熊相信，3D打印具有很多的優勢，在不斷的進步下，將成為醫學界不可或缺的技術。
表3：用于增材制造的實驗性SP的例案例
材料
形式
過程
瓊脂糖水凝膠
生物墨水
EBB
海藻酸鹽水凝膠
生物墨水
EBB
生物基PE-云杉木漿纖維
長絲
ME
纖維素納米纖維-牛奶
漿料
ME
纖維素納米纖維-淀粉
漿料
ME
纖維素納米纖維-水
正如Simsa所解釋的那樣：“使用Felix 3D打印機，增材制造工藝的原理是擠出一系列基于植物的生物墨水。我們有一個3D打印過程，可以通過不同的打印頭擠出不同的植物性成分--我們的'食品墨水'。通過這種特殊的工藝，我們實現了三文魚片的復雜外觀，它顯示了橙色/紅色肉組織和白色結締組織的真實分布。"
Healshape的生物墨水技術目前已受到專利保護。
馬凱特補充說："最初，這項技術是為打印皮膚替代品而開發的。對于Healshape項目，有必要使工藝適應打印量，并確保生物墨水的后續鞏固，使其與體內的植入兼容"。
Healshape的3D生物打印技術目前處于臨床前階段，臨床試驗預計將在未來兩年內開始。
（圖3）
圖3 使用MB生物墨水的3D打印能力和保真度
然后研究者比較了不同墨水的力學性能，與GelMA本體水凝膠相比，MB生物墨水和JM生物墨水表現出更大的彈性，此外，對于MB生物墨水來說，微凝膠在壓縮條件下被進一步限制在第二個網絡內，因此與JM生物墨水相比具有相對較高的彈性模量。MB生物墨水具有非凡的結構穩健性和循環性能。
通過使用具有精確可控溫度的冷凍板設計以及冷凍保護生物墨水的優化，來研究冷凍生物打印的可行性和有效性（圖 1）。有意思的是，原位冷凍過程進一步提高了載有細胞的水凝膠生物墨水的可打印性，以實現打印自由形式的結構。研究進一步評估了生物墨水不同成分在低溫冷凍生物打印環境下對細胞活性的影響，而功能性最終通過細胞分化和雞胚離體實驗進行了驗證。
Inventia Life Science使用的PEG生物墨水無需熱刺激即可在接觸時結合，通過“矩陣構建塊”的方式進行生物3D打印。
△數字化打印
以這種“數字生物打印”技術為基礎，Inventia成功開發出第一臺生物3D打印機：RASTRUM。
作為生物打印的主體，生物墨水的角色尤其重要。3D生物打印的臨床轉化與新一代的生物墨水的開發密不可分。對此，弗萊堡大學高分子研究所的Shastrilab對目前3D生物打印技術（擠壓成型式）進行了總結并提出生物墨水開發的五個階段（TRL1-5），生物墨水需要具備的特性和標準化的工具，以期對未來研究3D生物打印的研究者提供一些參考（圖1）。
將微流控混合器整合至打印機生物墨水槽的前端，可精確、即時的通過調控墨水的流量來實現生物墨水的梯度變化（圖1）。該設計同時免于更換生物墨水時的沖洗步驟，進一步提高了梯度打印的打印速度并且達到節約墨水的目的。
圖1 可組合梯度 DLP三維生物打印平臺由微流控混合器墨水槽及DLP打印系統組成。
