【背景介紹】

熒光顯微成像技術(shù)因其高分辨力和低侵入性，已成為生物醫(yī)學(xué)研究和診療中重要的觀測手段。但是，由于光學(xué)衍射極限的存在，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微術(shù)的分辨能力在200 nm左右，無法滿足亞細(xì)胞尺度的觀測需求，而超分辨顯微技術(shù)則打破了技術(shù)瓶頸，實現(xiàn)了超越光學(xué)衍射極限的分辨能力。STED超分辨顯微術(shù)的發(fā)明者Stefan Hell因這項技術(shù)與PALM超分辨顯微術(shù)的發(fā)明者共同獲得了2014年諾貝爾化學(xué)獎，STED顯微術(shù)也因其極高的分辨能力而受到廣泛關(guān)注。

STED超分辨技術(shù)的基本原理如下：一束符合光學(xué)衍射極限的激光作為激發(fā)光，把熒光探針的電子激發(fā)到激發(fā)態(tài)；另一束激光作為擦除光，其光斑經(jīng)過調(diào)制，中心能量很低，形成類似“甜甜圈”的光斑，被激發(fā)光激發(fā)后的熒光探針在被擦除光照射后，將發(fā)生與擦除光波長相同的受激輻射，只有處于擦除光中心沒有能量的部分會發(fā)射熒光。如此一來，發(fā)射熒光的半徑是由“甜甜圈”的中心半徑?jīng)Q定的，而不是激發(fā)光的半徑?jīng)Q定的，即小于衍射極限半徑。

但是，STED顯微成像對熒光探針的要求極為苛刻，首先，熒光材料需要具備很高的受激輻射效率，這樣一來才能獲得較好的“擦除”效果；其次，熒光材料需要極高的光穩(wěn)定性，因為一般來說擦除光都是功率很高的激光，如果熒光探針容易被光漂白就無法實現(xiàn)STED成像；除此之外，熒光材料還需要具備較大的斯托克斯頻移，否則如果擦除光能被熒光材料吸收并發(fā)射熒光，會極大地影響成像效果。目前上轉(zhuǎn)換材料、量子點和一些有機(jī)染料都被用于STED，但是上轉(zhuǎn)換材料的熒光壽命太長，使得成像速度很慢，難以實現(xiàn)對生命過程的實時觀察；量子點普遍斯托克斯頻移很小，使得成像效果不盡如人意；傳統(tǒng)的有機(jī)染料雖然生物兼容性最好，且靶向性強(qiáng)，但是普遍斯托克斯頻移不大，并且光穩(wěn)定性不好，難以實現(xiàn)長時間的觀測。為了提高有機(jī)染料探針的光穩(wěn)定性，可以將染料包覆形成局部濃度很高的納米顆粒，但是由于傳統(tǒng)有機(jī)染料的聚集熒光猝滅（Aggregation caused quenching， ACQ）特性，使得納米顆粒的熒光效率急劇降低，這就與包覆染料的初衷相悖。

【成果簡介】

北京時間2017年10月4日，浙江大學(xué)錢駿教授，香港科技大學(xué)唐本忠院士（共同通訊作者）等人在Advanced Materials上發(fā)表了最新研究成果“AIE Nanoparticles with High Stimulated Emission Depletion Efficiency and Photobleaching Resistance for Long-Term Super-Resolution Bioimaging”。該團(tuán)隊報道了AIE材料聚集誘導(dǎo)熒光（Aggregation induced emission， AIE）納米顆粒用于STED超分辨成像具有得天獨厚的優(yōu)勢，在錢駿教授于2015年首次提出AIE納米顆粒具有STED超分辨成像潛力后實現(xiàn)了AIE材料在細(xì)胞內(nèi)的STED成像。與傳統(tǒng)有機(jī)染料的ACQ效應(yīng)截然相反，唐本忠院士團(tuán)隊于2001年發(fā)明的AIE材料在高濃度或聚集狀態(tài)時熒光效率急劇上升，這使得它的分子聚集后熒光效率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)，加之AIE材料的斯托克斯頻移較大，且兼具有機(jī)染料生物毒性小、靶向性高的優(yōu)勢，非常適合用作STED顯微成像的熒光探針。報道中選用的AIE材料是一種已被用于各種細(xì)胞追蹤、靶向標(biāo)記的“明星分子”，TPE-TPA-FN，其包覆形成的納米顆粒表現(xiàn)出很高的受激輻射擦除效率，在平均功率312.5 mW的皮秒擦除光作用下，能“擦掉”60%的熒光，也因此在后續(xù)的細(xì)胞實驗中得到了30 nm的高分辨力。更令人驚喜的是，由于其極高的光穩(wěn)定性，在被峰值功率極高的擦除光連續(xù)照射半小時以上后，其熒光強(qiáng)度依然能夠達(dá)到初始強(qiáng)度的70％，這意味著它能夠?qū)ι^程進(jìn)行長時間的、實時的超分辨觀測。

自AIE材料被發(fā)明以來，十幾年間，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞器靶向、胞內(nèi)黏度探測、生物大分子的追蹤以及癌癥治療。AIE材料可以被用作超分辨成像探針，無疑是一個重要的發(fā)現(xiàn)，它意味著許許多多納米尺度的生命過程可以被觀察、研究，意味著更多生命的秘密得以被人類破解。

本工作在開展期間獲得了上海宇北醫(yī)療器械有限公司的大力支持；并得到了國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2013CB834701和 2013CB834704）、浙江省杰出青年科學(xué)基金（LR17F050001）等資助，在此一并表示感謝。

【圖文導(dǎo)讀】

圖1 AIE納米顆粒合成方法

圖2 AIE顆粒的基本光學(xué)性質(zhì)、光路圖及顆粒的受激擦出能力

圖3 AIE顆粒體外STED超分辨成像

圖4 AIE顆粒光穩(wěn)定性

圖5 AIE顆粒在細(xì)胞內(nèi)的STED超分辨成像及光穩(wěn)定性

文獻(xiàn)鏈接：AIE Nanoparticles with High Stimulated Emission Depletion Efficiency and Photobleaching Resistance for Long-Term Super-Resolution Bioimaging (Advanced Materials, 2017, DOI: 10.1002/adma.201703643)

本文轉(zhuǎn)自材料牛，文/浙江大學(xué)錢駿教授團(tuán)隊