紫外-可見分光光度法，又稱紫外-可見吸收光譜法（ultraviolet and visible spectrum），是以紫外線-可見光區域（通常200-800 nm）電磁波連續光譜作為光源照射樣品，研究物質分子對光吸收的相對強度的方法。物質中的分子或基團，吸收了入射的紫外-可見光能量，電子間能級躍遷產生具有特征性的紫外-可見光譜，可用于確定化合物的結構和表征化合物的性質。紫外-可見吸收光譜在化學、材料、生物、醫學、食品、環境等領域都有廣泛的應用。

圖1 國高材分析測試中心

紫外-可見分光光度計

技術參數：

• 光源: 氙
• 光學系統: 雙光束
• 波長范圍: 190 nm – 1100 nm
• 檢測器: 雙硅光電二極管
• 透射比重復性: 1 A: ±0.0002 A
• 波長精度: ±0.5 nm (541.9, 546.1 nm 汞線)；±0.8 nm (190 – 1100 nm 全范圍)
• 波長重復性: ≤0.05 nm (546.1 nm 汞線，10 次測量的 SD)
• 基線平坦度: ±0.001 A，200 – 800 nm，1.0 nm SBW，平滑化
• 光度范圍: >3.5 A

01

紫外-可見分光光度計結構

分光光度法使用的儀器是分光光度計。分光光度計是由光源、分光系統（單色器）、吸收池、檢測器和測量信號顯示系統（記錄裝置）這五個基本部件組成的，如圖2所示。由光源產生的復合光通過單色器分解為單色光，當單色光通過吸收池時，一部分光被樣品吸收，未被吸收的光到達接收放大器，將光信號轉變成電信號并加以放大，放大后的電信號再顯示或記錄下來。

圖2 紫外-可見分光光度計基本結構示意圖

光源：對光源的的基本要求是在廣發的光譜區域內發射連續光譜；有足夠的輻射強度；光源有良好的穩定性；輻射能量隨波長沒有明顯的變化。在紫外及可見分光光度計上，常用的光源是鎢絲燈和氫燈（氘燈）。鎢絲燈受熱造成鎢蒸發損耗，可加入適量鹵素或鹵化物構成鹵鎢燈，延長使用壽命。

單色器：將光源發射的復合光分解成單色光并可從中選出任一波長單色光的光學系統。如圖4所示，主要由狹縫、色散原件和透鏡系統組成。

圖3 不同光源適用波長范圍

圖4 單色器光路示意圖

吸收池：又叫比色皿，如圖5所示，用于盛放待測溶液和決定透光液層厚度的器件。主要由石英吸收池和玻璃吸收池兩種。石英吸收池適用于紫外及可見光區，玻璃吸收池只能用于可見光區。

圖5 不同型號的比色皿

檢測器：利用光電效應將透過吸收池的光信號轉變為電信號。常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管、光電攝像管等。

02

測試分析及應用

2.1試樣制備

溶劑的選擇：選擇溶劑的一般原則是對試樣有良好的溶解能力和選擇性；測定在該波段溶劑本身無明顯吸收；溶劑不與被測組分發生化學反應；被測組分在溶劑中具有良好的吸收峰形。盡量選用低極性溶劑，溶劑極性較高時物質的精細結構消失，只得到很寬的吸收峰。

比色皿的使用：透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，注意比色皿的配對使用，比色皿內的溶液以皿高的2/3至4/5為宜。

2.2 定性分析

①把試樣的光譜特征，如吸收峰的數目、位置、強度（摩爾吸收系數）以及吸收峰的形狀（極大、極小和拐點），與純化合物或者文獻報道的標準紫外光譜圖做比較，推測化合物的結構，檢查化合物的純度。

圖6 ALE-ZnONPs、ALE和ZnSO4的紫外-可見吸收光譜圖

實例：沙特阿拉伯國王大學Mansour S. Al-Said等人利用紫外-可見吸收光譜確定所制備的樣品ALE-ZnONPs中含有氧化鋅納米顆粒。如圖6所示，樣品ALE-ZnONPs在375 nm出現了特征峰，制備樣品的原材料ALE和ZnSO₄在該處無特征峰。根據文獻報道，納米氧化鋅的特征峰在358-375 nm之間，由此證實了氧化鋅納米顆粒的生成。

②根據吸收峰的強弱對比比較樣品的相關性質。一種化合物可能擁有多個吸收峰，這些峰的相對強弱變化可以推測出化合物的相關性質。首先是根據文獻了解化合物的每個吸收峰所代表的含義，再進行對比。

圖7 P2-rn、P3-rn溶解性光學照片和紫外-可見吸收光譜圖。

（溶劑：1,2,4-三氯苯，濃度：2-10^-5mol/L）

實例：以基于異靛藍的聚合物P2-rn和P3-rn為例進行說明。在這類基于異靛藍的 D-A聚合物中，一般具有兩個吸收帶，band I和band II。band I又細分為0-0峰和0-1峰等，其中0-0峰表示分子的聚集狀態，越高說明聚集越強。這兩個聚合物結構的差異僅在其中一條烷基側鏈的大小不同，P3-rn的烷基側鏈比P3-rn的多出8個C原子。

從圖7中紫外-可見吸收光譜圖可以看出，從P2-rn到P3-rn，0-0峰的強度/0-1峰的強度減小，說明P3-rn在溶液中的聚集更弱，這和溶解性對比圖所示相吻合，相同濃度下，P3-rn的溶解性明顯較好，即分子更不易聚集，分散的更好。

2.3 半定量分析

根據吸收峰的強弱對比比較樣品的濃度大小關系。

實例：四川大學的郭熠等人利用紫外-可見吸收光譜對比了溶液中多硫化鋰的含量，從而進一步對比了樣品GSVm和GSm對多硫化鋰的吸附能力的強弱。將樣品GSVm和GSm分別放入相同濃度的多硫化鋰溶液中，靜置一段時間。樣品吸附多硫化鋰后，溶液中的多硫化鋰濃度改變。如圖8所示，測定吸附后溶液的紫外-可見吸收光譜，對比吸收峰的強弱，可以看出相較于原始的多硫化鋰溶液，加入樣品GSVm和GSm吸附后的多硫化鋰溶液吸收峰強度均降低，并且加入樣品GSVm吸附后的多硫化鋰溶液吸收峰強度下降更多，說明樣品GSVm吸附多硫化鋰能力更強，使溶液中多硫化鋰濃度下降更多。

圖8 浸泡了GSVm和GSm的 Li₂S_n 溶液的光學照片(插圖)和吸附后對應溶液的紫外-可見吸收光譜圖。

2.4 定量分析

單組分定量分析：①標準曲線法：直接分取標準溶液進行光度測定或顯色測定所測得的吸光度與濃度作圖得到的曲線（圖9）。②標準加入法（增量法）：把未知試樣溶液分成體積相同的若干份，除其中的一份不加入被測組分標準試樣外，在其他幾份中都分別加入不同量的標準試樣，然后測定各份試液的吸光度，并繪制吸光度對增量的校正曲線（圖10）。

圖9 標準曲線法校正曲線

圖10 增量法校正曲線

03

常見問題

3.1 儀器校準：別讓"跑偏"的波長毀了你的數據！

紫外分光光度計的波長校準是實驗的第一步，但很多人只是"例行公事"地做一下，結果測出來的吸收峰位置偏差，導致定性定量全錯！

關鍵操作：

• 波長校準：溫度變化會導致儀器機械部件微調，波長可能"跑偏"。除了定期全面校準外，每次測定前都要用標準物質（如氘燈或氧化鈥濾光片）校正波長，確保誤差在±1nm以內。
• 吸光度校準：用重鉻酸鉀的硫酸溶液（0.005 mol/L）檢查吸光度準確度，確保儀器響應線性。
• 
  

小貼士： 開機后至少預熱15分鐘，待儀器穩定后再測，否則數據波動大。

3.2 吸收池配對：你以為的"空白"可能并不空白！

石英吸收池在紫外區（220~270nm）也有吸收，而且每個池子的透光率可能不同。如果直接拿來就用，測出來的吸光度可能包含池子本身的誤差！

關鍵操作：

• 配對實驗：所有吸收池裝入空白溶劑，以其中一個為參比，測定其他池子的吸光度，選吸光度最小的配對使用。
• 使用技巧：手指只能捏毛玻璃面，透光面用擦鏡紙由上至下擦拭，避免指紋或溶劑殘留影響透光。
• 清洗方法：普通污染用水或乙醇洗，頑固污漬用發煙硫酸+硝酸（3:1）浸泡，但千萬別用鉻酸洗液長時間泡，否則會腐蝕光學表面。

避坑指南： 測揮發性溶液時記得加蓋，否則溶劑揮發后溶質會殘留在池壁上，導致下次測定誤差。

3.3 溶劑選擇：用錯溶劑，吸收峰直接"位移"！

溶劑可不是隨便選的！極性溶劑（如水、乙醇）可能讓溶質的吸收峰發生紅移或藍移，尤其是含氫鍵的化合物。

關鍵操作：

• 溶劑空白檢查：在測定波長附近掃描溶劑，確保無干擾吸收峰。
• 批次一致性：同一實驗盡量用同一廠家、同一批號的溶劑，避免因純度差異導致數據波動。

典型案例： 某實驗室用不同批次的甲醇測某藥物含量，結果偏差超5%，最后發現是溶劑雜質干擾。

4. 樣品測定：吸光度不在這個范圍，誤差翻倍！

供試品溶液的吸光度最好在0.3~0.7之間，此時儀器誤差最小。超出這個范圍，數據可信度直線下降。

關鍵操作：

• 濃度調整：若吸光度過高，適當稀釋；過低則濃縮或換光程更長的吸收池。
• 平行實驗：含量測定需稱取2份樣品，對照品比較法也要2份對照品，平行操作，偏差應≤±0.5%。

關鍵點： 在最大吸收峰±2nm內多測幾個點，確認峰位是否正確。若偏離藥典規定波長±1nm以上，可能樣品不純或儀器有問題。

5. 環境控制：溫濕度沒管好，儀器壽命減半！

關鍵要求：

• 溫度：建議實驗室維持在5~30°C，南方地區務必配空調，避免光學元件受熱變形。
• 濕度：超過75%會導致光柵、反射鏡鋁膜銹蝕，產生雜散光，數據漂移。
• 防塵：定期清潔樣品室，避免灰塵堆積影響光路。

6. 數據計算：兩種方法，別用錯公式！

易錯點：單位換算！吸收系數法要求濃度必須是1%（g/100ml），別當成mg/ml算錯了！