Cell：解決抗體研究40年難題，孟飛龍/葉菱秀團隊揭示抗體基因DNA的“剛柔相濟”，為開發超級抗體奠定基礎
抗疫三年，相信大家對“抗原”和“抗體”的概念已經非常熟悉。日本科學家利根川進因解開了抗體基因如何從1到100億的科學界難題，而榮獲了1987年諾貝爾生理學或醫學獎，這一成就也推動了科學研究進入分子免疫學時期。
多樣化的抗體是進化賦予機體對抗外界病原體入侵的強有力的武器，千百年來，抗體幫助人類戰勝天花病毒、流感病毒以及如今的新冠病毒等。小小的抗體分子之所以能夠“以萬變應萬變”，是因為B細胞工廠內有多道多樣化生產線。第一道生產線中的RAG重組酶負責隨機拼接抗體基因的V(D)J片段，將其加工成初級抗體庫。
然而這些初級抗體由于與抗原的親和力較低，還不能為機體提供完善的保護。為了提高初級抗體庫的親和力和多樣性，第二道生產線中的AID胞苷脫氨酶會對抗體基因進行二次加工，在抗體基因的互補決定區（CDR）引入高頻點突變，使抗體基因進一步經歷“七十二變”，打造“質”和“量”雙升級的次級抗體庫，為機體提供全面的免疫防護。
從進化的角度來講，突變發生在負責結合抗原的互補決定區（CDR）而不是負責維持結構穩定的框架區（FR）是最佳的選擇，因為這樣既可以增加抗體基因序列的多樣性，又不會對抗體的整體結構造成傷害。早在1982年，科學家們便提出了為什么CDR具有偏好性突變這個問題，但是四十多年來，領域內一直沒有給出令人信服的答案。
2023年4月24日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心孟飛龍團隊和上海交大醫學院上海市免疫學研究所葉菱秀團隊（博士生王燕燕為論文第一作者）在國際頂尖學術期刊 Cell 發表了題為：Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation 的研究長文（Research Article）。
該研究系統揭示了抗體基因互補決定區（CDR）偏好性突變背后的生化機制，特別是抗體基因編碼序列DNA柔韌性的重要生理作用。這項研究解決了困擾免疫學家40多年的科學難題，為優化現有動物模型及推動下一代抗體基因人源化動物模型的發展提供了全新的見解。
圖1：CDR區序列的柔韌性決定了偏好性突變
研究團隊首先從經典的生化方法出發，建立了AID體外生化反應新方法，通過分析27種有頜脊椎動物的超1000條抗體重鏈基因序列的體外突變特征，發現CDR突變偏好在使用體細胞高頻突變（SHM）作為主要抗體多樣化策略的四足動物（包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鴨嘴獸以及羊駝等）中高度保守（圖2），暗示了CDR突變偏好受DNA序列上下文的影響。
圖2：CDR突變偏好具有進化保守性
隨后，研究團隊在體內進行了驗證，將小鼠體內一段抗體基因DNA序列進行隨機替換，發現新的序列環境顯著改變了原始位點的突變頻率。緊接著，研究團隊進一步聚焦于一段CDR3序列，通過基因編輯快速獲得攜帶不同CDR3上下文序列小鼠模型，發現序列改變對突變頻率造成了不同程度的影響，并且序列改變越靠近AID的作用位點，對突變頻率的影響越大。
為了深入挖掘DNA序列特征，研究團隊結合分子動力學模擬及單分子熒光相關光譜實驗證明了AID的靶向偏好受單鏈DNA底物柔韌性的直接調控，尤其是緊鄰AID作用位點WRC（W=A/T，R=A/G）上游的6nt DNA序列組成。該位置富含嘧啶-嘧啶二核苷酸的柔性DNA序列（[-PyPy-]WRC）有利于結合AID，進而有助于突變的發生（圖3）。
圖3：柔性DNA序列更易結合AID
通過分析抗體基因序列特征以及突變譜式，該團隊發現抗體可變區基因CDR編碼序列在進化中獲得了高度柔韌性特征。同時，AID也進化出了表面正電荷片區。這種酶和底物的協同進化促進了CDR偏好性突變的發生。最后，研究團隊分別在B細胞系和小鼠體內將柔性DNA序列替換到低頻突變區，成功地將該區域逆轉為高頻突變區（圖4）。
圖4：柔性序列將FR區逆轉為類CDR區
綜上所述，這項工作從經典的生化方法出發，聯合高通量測序技術、分子動力學模擬以及單分子熒光相關光譜技術等多種研究手段，在生化、細胞和小鼠模型三個層面，以全新的角度全面揭示了DNA柔性調控抗體多樣化的分子機制，并且該機制在許多物種中都普遍存在。該研究為DNA力學性質調控細胞生命活動提供了有力的實證，揭示了密碼子也有非編碼功能。
該研究對如何發展下一代抗體基因人源化動物模型以及加速罕見抗體的發現具有關鍵性的指導意義，因為現有抗體基因人源化小鼠模型均適用胚系抗體基因序列，大大限制了體細胞高頻突變過程，這無疑限制了高親和力抗體產生的速度。相信這種中尺度序列特征的發現為從頭理性設計抗體基因，針對性解除限速步驟以及打造超級抗體提供了堅實的理論基礎。
中科院分子細胞科學卓越創新中心孟飛龍組博士研究生王燕燕為該論文的第一作者，孟飛龍研究員和葉菱秀研究員為該論文的共同通訊作者。該工作得到了哈佛醫學院著名免疫學家Frederick W. Alt教授、上海交通大學達林泰教授、上海交通大學醫學院鄭小琪教授、中國農業大學趙要風教授、瑞典卡羅林斯卡研究所Qiang Pan-Hammarstro?m教授、中科院杭州醫學所宋杰教授、中科院生物物理所黃紹輝教授、復旦大學曹志偉教授、中科院分子細胞科學卓越創新中心劉珈泉教授等合作者的大力支持。此外，上海師范大學博士研究生張森欣為該論文的數據分析提供了巨大幫助、上海交通大學博士研究生楊欣瑞為分子動力學模擬作出了重要貢獻。
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