近年來，生物催化已成為合成化合物的重要途徑，也常應用于工業規模的生產。為了應對工業經濟對生物催化反應的嚴苛要求，相關研究團隊在提高 反應時空產率 、底物轉化率和產物濃度等方面做出了許多努力。  

    由于酶在水相體系中往往更穩定，水性介質通常會被選作進行酶促反應的溶劑。然而，常見的工業化合物的水溶性通常很差，如果使用水溶液會導致底物負載量低和生產效率下降；同時，一些合成反應需要酶法與化學法聯用，部分化學催化劑只能在非水介質中使用。這就造成了在溶劑體系選擇方面的矛盾與難題。

 

最近，一篇入選了“ 2021 Green Chemistry Hot Articles ”的關于 生物催化反應溶劑 體系選擇的綜述文章進入了我們的視野，這一綜述對于酶賽這類生物催化領域的公司具有巨大幫助。Rother教授及其同事對不同的溶劑體系的優勢與挑戰進行了分析，并進一步挑選了適合不同體系的“非常規介質”。最后，他們還制作了流程圖，便于有合成需要的團隊能夠根據所需快速找到合適的溶劑體系。其中，酶賽的Marco Bocola博士也是這篇綜述的作者之一。

 

一、不同的生物催化反應溶劑體系

這篇綜述根據溶劑體系中水與其它溶劑含量所占比例不同，將體系分為水單相（純水相/共溶劑體系），兩相（雙相/水-底物體系）和非水單相體系（微水反應體系/純底物體系）三大類。體系具體組成可見下圖（ 原文 Fig.1）。

Fig. 1 不同溶液體系的相對水含量

 

1.1   水單相溶劑體系

水溶劑或緩沖溶液性質溫和且容易獲得，因此被視為最簡單的方法。它可以是純水相，也可以在水溶劑中添加適量能與水混溶的共溶劑以提高反應試劑溶解度（共溶劑還可以參與反應，例如輔因子再生）。

• 優勢：
  

     1）反應條件溫和，酶性質（穩定性、活性、選擇性等）穩定；

    2） 不存在雙相體系常見的中間相問題，如傳質困難、中間相處蛋白質失活等。

• 缺陷/挑戰：
  

    1）對于水溶性差的常見工業化合物，純水相體系的底物負載量低，更適用于不需要高產品濃度的高價值產品；

    2）該類體系易產生大量廢水，且生成的產物提取分離較困難，在下游處理工藝（Downstream processing, DSP）上可能需要額外的能量/資源支出。

☆實例： 在使用醛肟脫水酶的脂肪腈合成中添加了10%乙醇作為共溶劑，1.4kg/L的底物轉化率成功達到93%，遠優于純水相體系及雙相體系。

參考文獻：A. Hinzmann, S. Glinski, M. Worm and H.Gr?ger.EnzymaticSynthesis of Aliphatic Nitriles at a Substrate Loading of up to 1.4 kg/L: ABiocatalytic Record Achieved with a Heme Protein J. Org.Chem., 2019, 84,4867–4872.

1.2   兩相溶劑體系

    兩相溶劑體系主要由兩相——水相和有機相（與水互不相溶）組成，底物溶解于有機相，而酶存在于水相中。在高濃度底物對酶無損害的情況下，底物可直接作為另一“有機相”出現，即“水-底物”體系（aqueous-neat）。

• 優勢：
  1）疏水底物在有機溶劑中溶解度更高，提高底物負載量能夠有效提高最終產率；
  2）雙相分離更容易，在DSP上有優勢。
• 缺陷/挑戰：
  1）可能存在酶不穩定問題；
  2）存在中間相問題，如傳質速率慢等。

☆實例：由于反應涉及的兩種酶中，TeSADH也可能會催化CHMO（環己酮單氧化物酶）的反應，Amin Bornadel的團隊決定選擇雙相體系來作為合成己內酯的溶劑體系。其挑選十二烷作為溶劑，將產物濃度從水相中的20mM提升到53mM。

參考文獻: A. Bornadel, R.Hatti-Kaul, F. Hollmann and S. Kara. A Bi-enzymatic Convergent Cascade forε-Caprolactone Synthesis Employing 1,6-Hexanediol as a ‘Double-SmartCosubstrate’. ChemCatChem, 2015, 7, 2442–2445.

1.3   非水單相溶劑體系——MARS

MARS，即微水反應體系(micro-aqueous reaction system)的簡稱，其主要組成為非水溶劑（如疏水有機溶劑），僅含有飽和量的水形成水化膜包裹生物 催化劑，以保持酶的活性。

• 優勢：
  

    1）底物負載量更高；

    2）水含量少，適合需要避免水的反應，如反應試劑發生水解；

    3）不存在中間相問題；

    4）產生廢水量少，DSP處理更簡單，且便于溶劑循環使用。

• 缺陷/挑戰：

    1）可能存在酶不穩定問題（然而某些實例中，該體系能夠提高酶穩定性）。

☆實例：在合成1-苯基-1,2-丙二醇的路線中，Rother團隊采用MARS體系來替代單水相，將底物濃度從26mM提高至440mM，且最終產物濃度為水相中的1600倍。

參考文獻: A. Jakoblinnert and D.Rother. A two-step biocatalytic cascade in micro-aqueous medium: using wholecells to obtain high concentrations of a vicinal diol. Green Chem., 2014, 16, 3472–3482.
 

1.4   非水單相溶劑體系——純底物

另一種非水單相溶劑體系為純底物體系，即無其他溶劑，酶分散在底物中，可能含有少量水以保持酶的穩定性。這就要求底物本身為液體狀態。

• 優勢：

    1）四種體系中，其底物負載量最高，相應的產物濃度也最高；
    2）與MARS優點類似，DSP處理簡單，無中間相問題等。

• 缺陷/挑戰：

    1）可能存在酶不穩定問題；

    2）很難實現完全轉化。

☆實例：酶賽團隊進化轉氨酶以用于R-苯乙胺的合成，并在該路線中嘗試了多種溶劑體系。我們發現了一個有趣的現象，即隨著溶劑體系中水含量的減少和底物負載量的增加，酶相對活性的變化并不是線性的，而是水單相>純底物>雙相，如下圖所示（原文Fig.2）。

Fig. 2 不同溶液體系轉氨酶對苯乙酮和異丙胺活性變化

    其具體反應數值如下（反應時間均為24h）：
    水單相：苯乙酮50g/L，轉化率80%，ee值99%
    雙相：苯乙酮400g/L，轉化率5%，產物濃度20g/L
    純底物（2%含PLP和濕細胞的水溶液）：產物濃度100g/L。進一步使用連續反應器，時空產率每24h可達到168g/L 。

參考專利: CN111349666A；US20200332321A1
 

1.5   溶劑體系的選擇

對于不同的反應，選擇溶劑體系時考慮的因素也不盡相同。而溶劑體系種類多樣，如何選擇合適的溶劑體系就是一個難點。這篇綜述中，幾位作者為研發團隊及工業生產提供了一張流程圖，對于溶劑體系的選擇具有非常大的幫助（原文Fig.3&4）。

Fig. 3 &4決定哪種溶劑體系適合生物催化反應的流程圖

（圖中藍色框為查閱文獻即可解決的問題，而橙色框中的疑問需要實驗驗證）

 

二、非常規溶劑的選擇

通過流程圖確定溶劑體系后，就需要進一步選擇反應中所用的溶劑。在選擇溶劑時，需要考慮的因素是多樣的，這篇綜述中主要分為了兩類——對反應的影響/對環境的影響。

2.1  常見非水溶劑及其應用
      除了最常用的有機溶劑外，文獻中還提及了其他幾種溶劑。
     離子液體（ionic liquids, ILs） 和 低共熔試劑（deep eutectic solvents, DESs） 都是最常見的有機溶劑替代品，前者是通過陰陽離子松散結合形成的液體，后者則有鹵化物鹽和氫鍵供體組成。 兩者均具有非揮發性和不可燃性的特點，這使它們安全且易后續處理。 然而，ILs的生產過程繁瑣，相反的能夠以可再生能源合成DESs就成了更具優勢的替代品。

而 超臨界流體（supercrtical fluids, SCFs） 是一種新興的溶劑， 其在特定壓力和溫度下為介于液態和氣態的氣體，能夠通過改變反應溫度與壓力來改變其溶解能力。最常見的例子為超臨界CO₂，含量豐富且不可燃，頗具優勢，但同時需要專用壓力設備，因此普通實驗室無法使用。

下表（原文Table 4）列舉了以上幾種溶劑的應用體系（顏色越深，應用該溶劑的相關文獻越多），溶解度影響因素及實例。

Table 4 幾種溶劑在文獻中的生物催化的相關應用案例、一般特點和常見例子

*DMSO:二甲亞砜；CPME: 環戊基甲醚；MBTE: 甲基叔丁醚

*[BMim]:1-丁基-3-甲基咪唑；[Bpy]: N-丁基吡啶；ChCl: 氯化膽堿；[EACl]: 乙基氯化銨

 

2.2  溶劑對反應的影響

要提到溶劑對反應的影響，最需要考慮的因素有兩點：對酶性質（穩定性、活性和選擇性）的影響和溶解性，在雙相體系中，還可以引申出化合物在溶劑中的分配系數。

而從整體工藝來看，下游處理工藝（DSP）的難易程度也應考慮在內。基于以上因素和綜述所述，可以整理出不同溶劑體系所適用的溶劑類型。

溶劑 體系	要求	選擇溶劑特征
共溶劑	1.能與水混溶； 2.能提高底物在水中的溶解度； 3.對酶特性影響小； 4.簡化后續廢水處理；	1.低LogP*或極性溶劑，如小分子醇類(如乙醇、異丙醇)等； 2.DMSO符合上述條件但分其離困難，DSP難度大。
雙相 體系	1.具有雙相，要求化合物在兩相中分配合理，提高負載量； 2.不影響反應進行(如溶劑對酶抑制，或影響穩定性等)。	1.適中的分配系數**（過高可能會損害酶）； 2.溶劑與溶質LogP值近似; 3.不影響酶對底物親和力。
MARS	1.提高底物負載量； 2.不影響反應進行(如溶劑對酶抑制，或影響穩定性等)。	1.非極性溶劑； 2.避免破壞水化膜，影響酶活性；提高底物溶解性。

*LogP表示某物質在正辛醇（油）和水中的分配系數比值的對數值，反映了物質在油水兩相中的分配情況。其值越大，表示該物質越親油，水溶性越差。

**影響分配系數因素：logP，接受氫/供氫能力，極化性，溶劑體積比，Hlidebrand溶解度參數等。

 

2.3  溶劑對環境的影響

關于溶劑對環境的影響，最常見的誤區是水易得且無毒，是“綠色溶劑”，而有機溶劑通是對環境不友好和不可持續發展的。然而事實上，由于化合物溶解性差，單水相體系常需要使用大量水并相應產生污染廢水，而且提取產物時還需用到大量提取試劑；而有機溶劑盡管大部分確實容易增加環境負擔，但同樣存在對環境影響小的，例如一些以可再生資源和環保方式生產的試劑（如低共熔溶劑），能夠被重復利用。

同時，DSP處理的難易程度與對環境的有利程度并不完全相關。DSP處理的影響因素有溶劑粘度、揮發性、穩定性、共沸混合物的形成等，而對環境是否友好看的是溶劑揮發性、穩定性、閃點、爆炸性、毒性等。

因此，我們需要做的不是一味否定非水溶劑，而是在選擇溶劑前合理評估其對環境的影響。CHEM21和Prat團隊等研究組織對許多常用溶劑的特性進行了概括整理，并從安全，健康和環境的方面將它們分為了三類：“推薦使用”，“疑問的”，“危險的”。其中某些例子可見下表（原文Table 5）.

Table 5 生物催化溶劑的具體例子及其安全等級

*Cyrene：二氫左旋葡萄糖苷；p-Cymene：對傘花烴；Limonene：檸檬烯

 

三、酶穩定性問題的解決方案

    有機溶劑對酶的穩定性有或多或少的影響，綜述中主要有以下幾個解決方案:

• 蛋白質工程以提高酶的某些特性，如耐熱性、溶劑耐受性等，幾種特性的提高往往是同步的；
• 蛋白質表面修飾；
• 改變酶的狀態。例如，通過包埋/包封等手段固定化酶，或者選擇全細胞（溶劑耐受性菌株）反應來替代游離酶；
• 尋找可進行類似反應，但溶劑耐受性更高的其他酶作為替代品。

 

    這篇綜述還列舉了不同狀態酶的優勢及挑戰，具體可見下表（原文Table 3）。

Table 3 不同狀態酶的優勢、挑戰
及在不同反應體系中的應用

 

四、前景展望

本文作者認為，我們不能一直拘泥于在生物催化反應中使用水單相體系，隨著各類化合物的需求上升，非水溶劑的應 用是不可避免的。

當然，目前有機溶劑還存在不少的問題與挑戰亟需解決。例如，目前某種溶劑在某反應中的適合程度難以預測，但作者認為在不久的將來應該會有 更多的模擬工具幫助選擇最合適的溶劑。而關于有機溶劑的合成過程，可以從原料（可再生資源）和合成方法（生物合成，發酵等）兩方面著手。

本文的最后，作者鼓勵在生物催化領域的各研究團隊能夠多嘗試不同的溶劑體系和非常規介質，這是擴大和推動這些溶劑在工業領域應用的最好方式。同時，將酶和化學催化反應結合的級聯反應，在有機溶劑的擴展應用下也將具有重要潛力。

文章來源：酶賽生物

撰稿 | 戴怡昕