CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)顯著改變了基因編輯領(lǐng)域的格局，為科學(xué)家自由操縱基因提供了前所未有的簡便和高效。然而，目前CRISPR技術(shù)并非完美無缺，仍存在一定局限性，并面臨許多挑戰(zhàn)。
常規(guī)CRISPR技術(shù)通常依靠病毒載體來遞送到細胞中，但病毒載體往往成本高昂且耗費資源，因此，制造大量臨床級病毒載體一直是CRISPR技術(shù)臨床應(yīng)用的主要瓶頸之一。此外，傳統(tǒng)病毒載體
（慢病毒載體）
在基因組中插入基因的位點具有隨機性，難以對其進行精準(zhǔn)控制，因此具有潛在致癌性風(fēng)險。
近日，美國加州大學(xué)舊金山分校的研究人員在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表題為：
High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails
的研究論文。
該研究開發(fā)了一種改進型CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，
無需病毒載體即可非常高效地將長DNA序列精準(zhǔn)引入細胞基因組的精確位置，實現(xiàn)比常規(guī)CRISPR技術(shù)高2-3倍的編輯效率。而且，能夠一次性產(chǎn)生高達10億個CAR-T細胞，這
為下一代安全高效的基于CRISPR的細胞療法打開了新的大門。
在經(jīng)典的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)中，需要使用高濃度的雙鏈DNA
（dsDNA）
和Cas9靶序列來增強CRISPR介導(dǎo)的插入效率，但這可能對原代細胞產(chǎn)生較強的毒性。與之相對，單鏈DNA
（ssDNA）
對細胞的毒性較小，即使在相對較高的濃度下也是如此。
此外，為了克服常規(guī)CRISPR技術(shù)需要病毒載體的弊端，多年以來，研究團隊一直致力于將更長的DNA序列以一種不依賴病毒載體的方式插入到基因組中的特定位點，并實現(xiàn)更高效的基因編輯。
在這最新研究中，研究團隊開發(fā)了一種新型CRISPR系統(tǒng)，利用結(jié)合Cas9靶序列的單鏈DNA
（ssDNA）
HDR模板
（HDRT）
，實現(xiàn)了相對于dsDNA的2-3倍的敲入效率和產(chǎn)量。此外，這種方法不依賴于病毒載體，允許科學(xué)家將特別長的DNA序列引入細胞基因組的精確位置。
不僅如此，研究團隊還展示了如何利用新型CRISPR系統(tǒng)來快速生產(chǎn)CAR-T細胞。CAR-T細胞是近年來十分火熱的免疫療法，該技術(shù)從患者身上取下T細胞并對其進行改造，在對抗多發(fā)性骨髓瘤等血液腫瘤血癌展現(xiàn)出良好的前景。
研究團隊使用新的DNA模板生成了超過10億個靶向多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T細胞，其中大約一半的T細胞獲得了新基因并轉(zhuǎn)化為CAR-T細胞。研究人員將DNA模板定位到基因組中的一個特定位置，稱為TRAC位點，這有助于提高CAR-T細胞的抗腫瘤能力。
利用新型CRISPR系統(tǒng)來快速生產(chǎn)CAR-T細胞
該研究的第一作者Brian Shy博士表示，他們開發(fā)的新型CRISPR系統(tǒng)可以在一次運行中設(shè)計超過10億個CAR-T細胞，這遠超治療單個病人所需的細胞數(shù)量。并且，由于不需要昂貴的病毒載體，這種新型CRISPR系統(tǒng)不受成本、制造復(fù)雜性和供應(yīng)鏈挑戰(zhàn)的限制，使得新的細胞和基因療法更快、更好、更便宜。
新型CRISPR系統(tǒng)可以在一次運行中設(shè)計超過10億個CAR-T細胞
此外，研究人員首次表明，他們的方法可以完全替代與罕見遺傳免疫疾病相關(guān)的兩個基因，即IL2RA和CTLA4。過去已有研究證明可以替換IL2RA基因的突變片段，如今，這項最新研究表明，可以一次性替換整個IL2RA和CTLA4基因，這是一種“一刀切”的方法，可以同時治療在同一個基因上有不同突變位點的患者，而不必為每個患者的突變生成個性化的模板。
更重要的是，研究結(jié)果顯示，用這種基因工程方法處理的細胞中，近90%獲得了健康的基因版本。目前，研究團隊正推進在CAR-T細胞治療和IL2RA基因缺陷治療中使用這種新型非病毒CRISPR技術(shù)的臨床試驗。
總的來說，這項發(fā)表在 Nature Biotechnology 上的研究開發(fā)了一種新型的、不依賴病毒載體的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)比常規(guī)CRISPR技術(shù)高2-3倍的編輯效率。這種新的非病毒方法能夠更有效地實現(xiàn)靶向性，并加速下一代CAR-T細胞療法的發(fā)展。
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01418-8
文章來源：生物世界
作者：nagashi
