研究內容：本文采用分子對接和分子動力學模擬方法研究了APOE3、APOE4與VAMP2蛋白的分子識別過程。

1. 研究背景

APOE蛋白由317個氨基酸殘基組成，其中1-18位的氨基酸為信號肽，經過翻譯修飾后被切掉。具有生物活性的APOE蛋白由299個氨基酸殘基組成。有三個主要的APOE等位基因變體，分別為APOE2,APOE3和APOE4。三個相應的基因等位基因編碼的APOE同工型僅在位置112和158位彼此不同（APOE2中的Cys112和Cys158; APOE3中的Cys112和Arg158; APOE4中的Arg112和Arg158）。

VAMP2蛋白的主要功能是將突觸小泡靶向和/或融合至靶膜。實驗研究發現，VAMP2可以與三種APOE酶進行結合，但是結合的親和力大小不同。因此為了深入研究VAMP2與APOE3、APOE4蛋白親和力差異的主要原因，本文采用分子動力學模擬（Molecular dynamics simulation）方法對VAMP2與APOE蛋白的分子識別展開了研究。

1. 模擬方法

• APOE與Vamp2晶體結構的獲取

從蛋白質數據庫(Protein data bank, PDB)獲取完整的APOE3蛋白晶體結構，PDB編號為2L7B[1]。APOE4與APOE3僅112位的氨基酸存在差異，APOE2與APOE3158位的氨基酸殘基存在差異。因此先用PyMOL 2.1[2]將APOE3蛋白112位的Cys殘基突變為Arg作為APOE4蛋白的初始結構，APOE3蛋白的158位的Arg殘基突變為Cys作為APOE2蛋白的初始結構，隨后用Gromacs軟件分別對APOE4和APOE2蛋白進行20 ns的分子動力學模擬，以最終平衡時候的結構用于與Vamp2蛋白對接。

由于Vamp2蛋白沒有完整的晶體結構，因此需要同源建模來構建其完整結構。用軟件Modeller 9.24[3]進行單模板建模，Swiss-model[4]進行模板搜索，選擇PDB編號為3HD7[5]的蛋白作為建模的模板，同源性為100%，分辨率為3.4 ?。并采用Rosetta軟件中的FastRelax模塊進行結構優化[6]，構象生成數為1000。并用線上模型質量評價服務器SAVES v5.0[7]對建模后的蛋白進行質量評價。

• 蛋白-蛋白對接

線上服務器Swarmdock Server[8]分別對接APOE2、APOE3、APOE4與Vamp2。對接類型為盲對接，產生模型數量設置為20。最后根據對接打分，選擇最優復合物構象作為分子動力學模擬的初始結構。

• 分子動力學模擬

MD模擬采用Gromacs 2018.4程序[9]，在恒溫恒壓以及周期性邊界條件下進行。應用Amber99sb-ildn全原子力場，TIP3P水模型[10]。在MD模擬過程中，所有涉及氫鍵采用LINCS算法[11]進行約束，積分步長為2 fs。靜電相互作用采用（Particle-mesh Ewald）PME方法[12]計算，截斷值設為1.2 nm。非鍵相互作用截斷值設為10 ?，每10步更新一次。采用V-rescale [13]溫度耦合方法控制模擬溫度為300 K，采用Berendsen方法控制壓力為1 bar。首先，采用最陡下降法對兩個體系進行能量最小化，以消除原子間過近的接觸；然后，在300 K進行100 ps的NVT平衡模擬；最后，對APOE3-VAMP2和APOE4-VAMP2兩個復合物體系不同體系分別進行100 ns的MD模擬，每10 ps保存一次構象，模擬結果可視化采用Gromacs內嵌程序和VMD完成。并用g_mmpbsa程序分別計算APOE3和APOE4與Vamp2蛋白的結合自由能。

1. 結果與分析

• APOE4蛋白結構收斂性分析

均方根偏差(Root mean square deviation, RMSD)表示某一時刻的構象與目標構象所有原子偏差的加和，是衡量體系是否穩定的重要依據。從圖1可以看出，APOE4經過20 ns的動力學模擬，從10 ns開始APOE4蛋白的RMSD值趨于穩定，平均值為0.5238±0.0212 nm。APOE2經過20 ns的動力學模擬，從5 ns開始APOE2蛋白的RMSD值趨于穩定，平均值為0.3919±0.0129 nm因此兩者可以用于后續的蛋白相互作用研究。

圖1 APOE4(a), APOE2(b)蛋白的RMSD值隨MD模擬時間的變化

• 同源建模模型質量評價

本文分別用PROCHECK程序對優化后的蛋白模型進行了評價。Ramachandran plot用于闡述蛋白質或肽立體結構中肽鍵內α碳原子和羰基碳原子間的鍵的旋轉度對α碳原子和氮原子間的鍵的旋轉度，主要用來指明蛋白質或肽類中氨基酸殘基的允許和不允許的構象。Ramachandran plot主要分為三個區域，允許區（紅色區域），最大允許區（黃色區域），不允許區（空白區域）。圖2a給出了APE蛋白模型的Ramachandran plot結果，位于允許區的氨基酸占比98%，沒有氨基酸殘基位于扭轉角禁止區域，因此蛋白的所有氨基酸殘基的二面角均在合理范圍內，符合立體化學能量規則。

圖2 VAMP2蛋白模型的Ramachandran plot

• MD模擬收斂參數分析

均方根偏差(Root mean square deviation, RMSD)表示某一時刻的構象與目標構象所有原子偏差的加和，是衡量體系是否穩定的重要依據，可用于量化蛋白質三級結構的穩定性[21]。圖3a給出了APOE3-VAMP2，APOE4-VAMP2和APOE2-VAMP2復合物體系骨架原子的RMSD值隨時間的變化情況。從圖3a中可以看出兩個體系在模擬初期(0-20 ns)的RMSD變化趨勢及變化值相近，呈現逐步上升的趨勢，這主要是由于模擬剛開始蛋白與周圍水溶劑之間的相互作用造成蛋白結構的較大波動。整體來講，三個體系的RMSD值從50 ns后趨于穩定，APOE4-Vamp2體系的RMSD值為2.0738±0.0241 nm，波動幅度為1.16%，APOE3-Vamp2體系的RMSD值為2.4434±0.0993 nm，波動幅度為4.06%。APOE2-Vamp2體系的RMSD值為2.0574±0.0453 nm，波動幅度為2.21%。因此，APOE2-Vamp2，POE4-VAMP2體系在模擬過程中的RMSD值相對更小，表明AOPE2,APOE4與VAMP2形成的復合物體系比更加穩定。

回轉半徑（Radius of Gyration, Rg）可以用來描述整體結構的變化情況，可用于表征蛋白質結構的緊密程度，Rg變化越大表明體系越膨脹。從圖3b可以看出三個體系的Rg值在模擬的前20 ns呈逐漸降低的趨勢，主要是由于VAMP2較長的α螺旋在模擬過程中逐漸靠近APOE蛋白，二者的結構變得更加緊密。從60 ns開始AOPE3-Vamp2，AOPE4-Vamp2復合體系的Rg趨于穩定，AOPE3-Vamp2，AOPE4-Vamp2的Rg值分別為2.500±0.013nm，2.382±0.030 nm， APOE4-VAMP2體系的Rg值相對更小，表明VAMP2與APOE4形成 額 復合物結構比APOE3更加緊密，因此推測二者的相互作用可能更強。AOPE2-Vamp2在60ns處有一個波動，從80 ns開始處于一個穩定的狀態，Rg值為2.465±0.031 nm，表明VAMP2與APOE2形成復合物結構比APOE3更加緊密，但弱于APOE4與Vamp2的復合物。

圖3 APOE3-VAMP2，APOE4-VAMP2和APOE2-VAMP2體系的RMSD（a）和Rg（b）隨MD模擬時間的變化

• APOE蛋白柔性分析

均方根漲落（Root mean square fluctuation, RMSF）可以表示蛋白質中氨基酸殘基的柔性大小。圖4分別給出了APOE2，APOE3和APOE4蛋白的氨基酸殘基RMSF分布。從圖中可以看出，APOE3和APOE4二者差別較大的區域主要有Ala160~Val190和Arg191~Glu205。從圖4b中可以看出，APOE4蛋白的Ala160~Val190區域更靠近VAMP2，受到VAMP2中氨基酸殘基的相互作用影響，因此其柔性相比APOE3更大；而APOE3結構中的Arg191~Glu205區域與VAMP2結構相互作用比APOE4中對應區域更強，因此其柔性相對更大。整體來講，APOE3和APOE4在模擬過程中蛋白的整體柔性分布基本一致，變化較大的區域主要原因是受到VAMP2結合的影響。APOE2與APOE4二者差別較大的區域主要有Ala237~Lys261和Arg191~Gly211。蛋白之間的相互作用可能導致這部分氨基酸殘基構象發生變化較其他區域劇烈，因此柔性更大。

圖4 APOE3和APOE4蛋白氨基酸殘基的柔性分布（a）以及各個區域在復合物結構中的位置（b）

• VAMP2與APOE蛋白相互作用分析

氫鍵是生物大分子維持結構穩定性的重要作用力之一，也是蛋白-蛋白相互作用的重要形式。因此，為了進一步分析VAMP2與APOE2，APOE3和APOE4蛋白的相互作用，本文對MD模擬過程中VAMP2與APOE蛋白之間的氫鍵數量進行了統計分析，如圖5a所示。從圖中可以看出，模擬過程中APOE4與VAMP2之間的氫鍵數量一直比APOE3，APOE2更多，平均值分別為16.74和12.20，15.42.

氫鍵作用是可以增強VAMP2與APOE蛋白之間的親和力，為了進一步評價蛋白之間親和力的大小差異，圖5b給出了APOE2，APOE3和APOE4蛋白與VAMP2在模擬過程中的結合自由能隨模擬時間的變化。從圖中可以看出，APOE蛋白與VAMP2的結合能在60 ns之后基本穩定，APOE2，APOE3和APOE4與VAMP2的結合能平均值分別為-548.851±116.578 kJ/mol，481.21±110.52 kJ/mol和-568.57±140.47 kJ/mol。

通過分析APOE蛋白與VAMP2之間的氫鍵作用和結合能，可以發現VAMP2與APOE4之間的氫鍵作用更強，進而使得二者的親和力也更強。

圖5 APOE蛋白與VAMP2之間氫鍵數量（a）和結合能（b）隨MD模擬時間的變化

• APOE3和APOE4與VAMP2結合的差異

為了進一步研究VAMP2與APOE蛋白結合的差異，圖6給出了VAMP2蛋白在APOE表面的結合模式。從圖中可以看出，VAMP2蛋白主要依靠結構中間的α螺旋與APOE蛋白進行結合，主要結合在APOE蛋白的親水性凹槽中，因此可以推測親水作用是二者的分子識別過程中的關鍵作用力之一。另外VAMP2蛋白與APOE蛋白結合表面附近也存在一些疏水區域，疏水作用也可以進一步增強蛋白的結合。圖6中還給出了VAMP2結構中可以與Snap25、Syntaxin蛋白形成SNARE復合物的區域（31-91），從圖中可以看出，SNARE區域可以與APOE蛋白完全結合，進而影響VAMP2與其他蛋白質的作用。

圖6 VAMP2在APOE3和APOE4蛋白表面的結合模式（cartoon模型表示VAMP2，紅色區域表示與Snap25、Syntaxin蛋白形成SNARE復合物的區域，APOE3和APOE4用surface模型表示，蛋白表面藍色和橙色區域分別表示親水和疏水區域）

前面通過分析模擬過程中APOE蛋白與VAMP2分子識別各種參數的差異，發現APOE4與VAMP2形成的復合物結構更加穩定，親和力更強。APOE3和APOE4的主要結構差異在112位氨基酸的變化，因此為了深入研究112位氨基酸突變所造成的與VAMP2結合的差異，本文對MD模擬之后APOE蛋白112位附近的氨基酸構象進行了分析，如圖7所示。從圖7a中可以看出，Cys112側鏈在APOE3和VAMP2的結合中沒有起到明顯的作用，APOE3和VAMP2的分子識別主要依靠Asp110和Lys91，Val185和Asn92之間的氫鍵作用，以及Val116、Val185（APOE3）與Leu99、Ile98、Met96、Met95、Leu93（VAMP2）之間的疏水作用。而在APOE4與VAMP2的結合模式中（圖7b），Arg112的側鏈翻轉朝向VAMP2蛋白，與Glu109形成了氫鍵作用，并且與VAMP2結構中的芳香性氨基酸Tyr88形成了Cation-π作用，Arg112與芳香性苯環質心距離為4.22 ?。另外APOE4中的Arg189也與VAMP2的Trp89形成了Cation-π作用，Arg189的主鏈和Asn92、Glu238和Lys91之間也存在氫鍵作用，進一步增強了APOE4與VAMP2的親和力。

圖7 APOE3（a）和APOE4（b）APOE3（c與VAMP2的結合模式（綠色和紅色虛線分別表示氫鍵作用和cation-π作用）

1. 結論

本文通過分子動力學模擬方法分別研究了Vamp2與APOE2，APOE3和APOE4的分子識別過程。通過分析模擬過程中的收斂參數變化、氫鍵以及結合能，發現APOE4-Vamp2復合物體系在模擬過程中比APOE3-Vamp2體系更加穩定，Vamp2與APOE4之間的親和力相對更強。最后通過分析112位突變點附近的氨基酸構象差異，發現Cys112突變為Arg112之后，不僅可以影響周圍氨基酸殘基的構象發生變化，形成更強的氫鍵作用，并且Arg112側鏈還可以與Vamp2上的Tyr88形成了Cation-π作用，Tyr88位于Vamp2的SNARE區域上，在進一步增強APOE4與VAMP2的相互作用的同時，還可以影響Vamp2與Snap25、Syntaxin蛋白的結合。Arg158突變為Cys后，APOE2蛋白與Vamp2在Cys附近的結合也會有所差別,APOE2蛋白的Glu109氨基酸殘基與Vamp2的Leu93氨基酸殘基之間形成氫鍵，距離為3.3A。另外APOE2蛋白的Gly120氨基酸殘基與Vamp2的Gly100氨基酸殘基之間形成氫鍵, 距離為4.2A。

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