對(duì)稱性是自然界的一個(gè)普遍現(xiàn)象，然而自然界中也存在一些對(duì)稱性破缺，例如：有些生物兩只眼睛有大有小，而比目魚的眼睛甚至長(zhǎng)在同側(cè)；細(xì)胞膜雙層成分的非對(duì)稱性，保證了生命活動(dòng)的高度有序性（圖1）。因此，研究對(duì)稱性破缺具有重要意義。

高分子囊泡是具有膜層、內(nèi)冠、外冠結(jié)構(gòu)的空心納米球（圖2），和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，在疾病診療、分子遞送等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。然而，利用化學(xué)方法構(gòu)筑的囊泡多為對(duì)稱冠囊泡（圖2），其內(nèi)冠和外冠在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上完全相同，因此難以實(shí)現(xiàn)功能分區(qū)。而非對(duì)稱冠囊泡則因具有不同的內(nèi)外冠層，可實(shí)現(xiàn)功能分區(qū)。目前，非對(duì)稱冠囊泡的制備方法主要包括兩嵌段共聚物共組裝、三嵌段或多嵌段聚合物自組裝、乳液法等。然而，上述方法均不能保證內(nèi)外冠層的100%的非對(duì)稱性。具有完全不同的內(nèi)冠和外冠結(jié)構(gòu)的非對(duì)稱冠囊泡，一直是高分子囊泡領(lǐng)域的一顆明珠，但是摘取她卻困難重重。因此，如何構(gòu)筑并表征完全非對(duì)稱冠囊泡，仍是大分子自組裝領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。

圖2. 對(duì)稱冠高分子囊泡示意圖

為了解決上述問題，同濟(jì)大學(xué)杜建忠教授課題組獨(dú)辟蹊徑，提出了一種膠束-囊泡轉(zhuǎn)變法，構(gòu)筑了完全非對(duì)稱冠囊泡，并提出了相應(yīng)的表征方法。該囊泡的構(gòu)筑策略如圖3所示。首先設(shè)計(jì)并合成了嵌段共聚物PEO₁₁₃-b-P(NIPAM₄₅-stat-CMA₁₀)-b-PDEA₂₈，然后自組裝形成膠束，最終轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)稱冠囊泡。其中，PEO始終作為親水外冠；PDEA起初作為膠束的疏水內(nèi)核，最終轉(zhuǎn)變成非對(duì)稱冠囊泡的內(nèi)冠；P(NIPAM-stat-CMA) 起初作為膠束的中間冠層或殼層，最終構(gòu)成非對(duì)稱冠囊泡的交聯(lián)膜層。由于PDEA內(nèi)冠在血液循環(huán)過程中可轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷膬?nèi)壁，因此該囊泡可大幅降低抗癌藥在遞送過程中的泄露。

圖3. 完全非對(duì)稱冠囊泡的構(gòu)筑策略

完全非對(duì)稱冠囊泡的形成過程如圖3所示：

（1）將聚合物直接分散在水中，自組裝形成初始膠束Proto-micelle（25 °C，pH 7.0）；

（2）升溫，膠束的中間冠層P(NIPAM₄₅-stat-CMA₁₀)脫水而轉(zhuǎn)變?yōu)闅樱纬墒旎z束Mature micelle（40 °C，pH 7.0）;

（3）將P(NIPAM₄₅-stat-CMA₁₀)殼層進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖贤饨宦?lián)以鎖住膠束內(nèi)核（該步驟是關(guān)鍵一步），形成交聯(lián)的熟化膠束Cross-linked mature micelle;

（4）調(diào)節(jié)溶液pH至4.0，PDEA內(nèi)核被質(zhì)子化形成親水的內(nèi)冠，然后形成PNIPAM脫水的非對(duì)稱冠囊泡Dehydrated asymmetric vesicle（40 °C，pH 4.0）。在該轉(zhuǎn)變過程中，粒徑由75 nm增加至108 nm，表面電勢(shì)無明顯變化（圖4），表明PDEA始終被限制在非對(duì)稱冠囊泡的內(nèi)部空腔。

（5）降溫至室溫，形成粒徑為230 nm的PNIPAM水化的非對(duì)稱冠囊泡Hydrated asymmetric vesicle（25 °C，pH 4.0），同樣地，其表面電勢(shì)未發(fā)生明顯改變，表明PDEA始終被限制在非對(duì)稱冠囊泡的內(nèi)部空腔。

圖4. 膠束-囊泡的轉(zhuǎn)變過程及囊泡膜層的水化過程

完全非對(duì)稱冠囊泡的結(jié)構(gòu)表征是另外一個(gè)難點(diǎn)。為此，作者提出了如下方法進(jìn)行表征：

（1）完全非對(duì)稱冠囊泡僅在內(nèi)冠選擇性沉積納米金

采用原位載金的方式來定位內(nèi)冠PDEA的分布，并以具有相同內(nèi)外冠的對(duì)稱冠囊泡作為對(duì)照，從而表征完全非對(duì)稱冠囊泡的結(jié)構(gòu)。圖5所示的TEM圖片表明金納米顆粒選擇性地生長(zhǎng)在非對(duì)稱冠囊泡的內(nèi)部，表明PDEA僅分布于非對(duì)稱冠囊泡的內(nèi)部空腔；而在對(duì)照組對(duì)稱冠囊泡中，金納米顆粒在其內(nèi)部和外部隨機(jī)生長(zhǎng)，表明PDEA分布于對(duì)稱冠囊泡的內(nèi)冠和外冠。

圖5. 完全非對(duì)稱冠囊泡和對(duì)稱冠囊泡載金前后的TEM表征

（2）完全非對(duì)稱冠囊泡在載金前后的表面電勢(shì)均為負(fù)值

完全非對(duì)稱冠囊泡在載金前后的表面電勢(shì)分別為 -8 mV和 -6 mV，無明顯改變。這表明帶有正電荷的PDEA僅分布在非對(duì)稱冠囊泡的內(nèi)部，而PEO則始終分布在非對(duì)稱冠囊泡的外部，具有電荷屏蔽作用。因此，載金前后非對(duì)稱冠囊泡的表面電勢(shì)基本不變；而在對(duì)稱冠囊泡中，載金前后的表面電勢(shì)分別為+23 mV 和 +14 mV，表明納米金的原位負(fù)載消耗了對(duì)稱冠囊泡外冠PDEA鏈段的部分正電荷，因此其表面電勢(shì)隨之降低（圖6B）。

（3）完全非對(duì)稱冠囊泡在載金前后具有較大的尺寸變化率

完全非對(duì)稱冠囊泡的尺寸在原位載金后減小了18%。這是因?yàn)榧{米金在PDEA內(nèi)冠上的原位生長(zhǎng)，消耗了其所帶正電荷，導(dǎo)致PDEA內(nèi)冠之間相互排斥作用減弱，非對(duì)稱冠囊泡的粒徑隨之減小；而在對(duì)稱冠囊泡中，PDEA在內(nèi)冠和外冠中均有分布，納米金的原位生長(zhǎng)對(duì)其內(nèi)部斥力的降低影響較小，故其尺寸變化率僅為4%（圖6C）。

圖6. 完全非對(duì)稱冠囊泡和對(duì)稱冠囊泡載金前后的表面電勢(shì)及尺寸變化

上述非對(duì)稱冠囊泡（25 °C，pH 4.0）在逐步調(diào)節(jié)pH至生理環(huán)境時(shí)（pH 7.4），PDEA內(nèi)冠因親水性降低而轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)壁。這種由生理環(huán)境變化引起的形貌轉(zhuǎn)變有望精確調(diào)控藥物控釋行為。在生理?xiàng)l件下，可將疏水性藥物負(fù)載在疏水的PDEA內(nèi)壁中，或者將親水性藥物包封于空腔中，即為藥物穿上了一件“防滲衣”，可在遞送過程中大幅降低藥物泄露。而在到達(dá)弱酸性的腫瘤區(qū)域時(shí)，PDEA內(nèi)壁因質(zhì)子化而轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水內(nèi)冠，同時(shí)加速藥物釋放。如圖7所示，載藥非對(duì)稱冠囊泡在pH 7.4的生理?xiàng)l件下釋藥速率很慢，48小時(shí)后的藥物釋放量?jī)H為13.5%。而在pH 4.0的酸性條件下則表現(xiàn)出持續(xù)的藥物釋放行為，48小時(shí)內(nèi)藥物釋放量達(dá)到71.4%。因此，該非對(duì)稱冠囊泡有望作為一種新型的精準(zhǔn)藥物遞送載體。

圖7. 非對(duì)稱冠囊泡可防止遞送過程中的藥物泄露

該成果以“Breaking the Corona Symmetry of Vesicles”為題發(fā)表在Macromolecules上（DOI: 10.1021/acs.macromol.1c00060，并當(dāng)選為正封面（front cover）。同濟(jì)大學(xué)博士生韋平是該論文的第一作者，杜建忠教授為通訊作者。

該項(xiàng)目得到國家杰出青年科學(xué)基金資助，感謝張江實(shí)驗(yàn)室國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施在冷凍電鏡方面的支持。

論文鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.macromol.1c00060

參考資料：

1. 比目魚和細(xì)胞膜的圖片來源于PNG素材網(wǎng)

http://www.pngsucai.com/png/6437243.html

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