北京大學呂華課題組報道了一種位點特異且結構明確的多重響應性干擾素-聚硫辛酰肼阿霉素-聚氨基酸偶聯物（IFN-PolyDox-PEP），用于腫瘤的聯合藥物治療。作者巧妙地將蛋白質-聚氨基酸的定點偶聯Grafting-to技術與原位冷凍聚合生長聚二硫化物的Grafting-from技術相結合，使不同種類的高分子材料在藥物遞送的各個階段充分發揮作用。首先，聚氨基酸的修飾顯著提升藥物的半衰期，有利于更好地實現藥物的腫瘤富集。隨后，腫瘤微環境高表達的MMP酶介導的酶切釋放出干擾素蛋白原藥，提高干擾素對腫瘤細胞表面干擾素受體的結合力，充分發揮干擾素的抗腫瘤活性。進一步，聚二硫化物的特殊入胞機制和解聚性能促進了阿霉素的胞內遞送和無痕釋放（圖1）。

圖1.（A）IFN-PolyDox-PEP的合成示意圖。（B）集MMP酶響應，酸響應和谷胱甘肽響應于一體，促進IFN和Dox靶向釋放，實現蛋白質-化療藥聯合用藥，增強抗腫瘤協同效應。

本工作選用干擾素（IFN）和阿霉素（Dox）來構建PDP偶聯物。首先通過基因工程技術在干擾素的N端引入基質金屬蛋白酶（MMP）可裂解的氨基酸序列，利用自然化學連接技術將端基含苯硫酯的聚氨基酸與N端帶有半胱氨酸的干擾素（Cys-M-IFN）反應，得到N端定點修飾的干擾素-聚氨基酸偶聯物（IFN-PEP）。隨后，利用干擾素的N端半胱氨酸殘基上的活性巰基，通過冷凍聚合定點原位引發硫辛酰肼的聚合，得到干擾素-聚硫辛酰肼-聚氨基酸偶聯物（IFN-PDS-PEP），并將阿霉素以酸響應的腙鍵共價連接到上述偶聯物中，最終得到干擾素-聚硫辛酰肼阿霉素-聚氨基酸偶聯物（IFN-PolyDox-PEP），并在溶液中自組裝形成水合直徑約為122 nm的殼核納米粒子（圖2A）。該納米粒子中的阿霉素和干擾素藥物分子的摩爾比高達103比1。

藥物釋放曲線結果表明，IFN-PolyDox-PEP 在模擬的正常生理環境（pH 7.4）下具有良好的穩定性，而在腫瘤微環境的弱酸性條件下（pH 6.0），腙鍵開始斷裂，阿霉素的釋放有所加速。腫瘤細胞內的高濃度谷胱甘肽（10 mM GSH）促進聚硫辛酰肼的解聚，使得納米粒子發生劇烈瓦解，從而更大程度地促進阿霉素的釋放（圖2B）。

圖2. （A） IFN-PolyDox-PEP的水合粒徑表征，插圖為TEM表征干態粒徑。（B）阿霉素隨時間的釋放曲線。以不同PBS緩沖液模擬體內環境。

在抗腫瘤細胞增殖實驗中，作者采用人卵巢癌 SKOV3細胞模型來驗證干擾素/阿霉素聯用的協同增強抗腫瘤作用。結果表明，相比于IFN-PEP或Dox的單一療法，物理混合的IFN-PEP聯合Dox用藥（IFN-PEP+Dox）展現了更為優異的抑制腫瘤細胞生長的效果，證明了協同效應的存在。由于阿霉素的可控緩釋，偶聯物IFN-PolyDox-PEP的毒性相比于物理混合組略顯溫和（圖3A）。

在細胞攝取實驗中，IFN-PolyDox-PEP與細胞孵育2小時后，細胞內部產生彌散的熒光信號，表明偶聯物相比于小分子Dox對照組，同樣實現了在細胞溶膠內的大量富集，并且沒有觀察到明顯的藥物被束縛在溶酶體中無法逃逸的現象（圖3B）。為進一步研究IFN-PolyDox-PEP的入胞機制，作者分別將SKOV3細胞用10 mM疊氮化鈉預處理以抑制內吞作用或用5,5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）來封閉細胞表面的巰基（圖3C）。結果表明，NaN3預處理的細胞對藥物攝取沒有顯示出明顯的下降（n.s.），而DTNB處理的細胞可抑制~25％的藥物攝取（P <0.01）。上述實驗結果表明，常規的內吞作用并不是IFN-PolyDox-PEP的主要入胞途徑，而二硫鍵交換介導的細胞穿透可能是其潛在的一種入胞機制。

圖3. IFN-PolyDox-PEP的體外細胞毒性和細胞攝取。（a）各組藥物對卵巢癌 SKOV3細胞的抗增殖活性。（b）Dox或IFN-PolyDox-PEP在不同時間點的細胞攝取的CLSM圖。細胞核以藍色顯示，Dox以綠色顯示。（c）通過不同的預處理，SKOV3細胞對IFN-PolyDox-PEP的相對攝取量的流式細胞術表征。

最后作者通過荷瘤小鼠模型的抑瘤生長實驗證明，相比IFN-PEP或Dox的單一療法，物理混合的Dox+IFN-PEP聯用能夠明顯抑制腫瘤生長，而IFN-PolyDox-PEP幾乎完全抑制了腫瘤的生長（圖4A），并且直到第27天都沒有出現小鼠死亡（圖4B）。H&E染色顯示，與單獨施用IFN-PEP或Dox相比，Dox + IFN-PEP和IFN-PolyDox-PEP組均引起更高程度的腫瘤細胞凋亡（圖4C）。在本實驗所采用的IFN和Dox的劑量下，所有治療組的小鼠均未觀察到明顯的體重下降（圖4D）。

圖4. IFN-PolyDox-PEP的抗腫瘤效果。（A）各組藥物抑制SKOV3腫瘤生長曲線。（B）小鼠生存率曲線。（C）各組腫瘤的H&E染色切片。（D）治療期間的小鼠體重變化曲線。

總結來說，本論文立足于位點特異性蛋白質-高分子偶聯物的簡潔開發，實現了干擾素和阿霉素的聯合遞送，并通過腫瘤微環境響應實現可控藥物釋放，為聚氨基酸和聚二硫化物等高分子材料在抗腫瘤藥物的聯合應用提供了新的范例。