圖1. 示意圖，顯示了負(fù)載吲哚菁綠（ICG）的仿病毒納米粒子（VM-T-L NPs）和對應(yīng)的對照粒子的制備、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞吞噬和光熱效應(yīng)。VM-T-L NPs表面具有刺突結(jié)構(gòu)和Tat /脂質(zhì)功能分子，對于增強細(xì)胞吞噬和ICG傳遞具有優(yōu)異的表現(xiàn)，可導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡和腫瘤抑制。

1. 通過一種新穎的pH響應(yīng)性分解誘導(dǎo)自組裝方法和后續(xù)功能成分修飾，制備了具有仿病毒形態(tài)和組成的納米粒子。

2. 以仿病毒納米粒子作為傳遞載體，極大提高了細(xì)胞吞噬、藥物傳遞效率和抗腫瘤作用。

1. 仿病毒形貌和成分的納米粒子的制備

首先，通過乳化-交聯(lián)法制備了殼聚糖納米粒子。通過醛基與氨基間的Schiff堿反應(yīng)將合成的2-醛基-5,10,15,20-四苯基卟啉（Por-CHO）接枝到殼聚糖納米粒子中的殼聚糖分子上，得到殼聚糖接枝卟啉納米粒子（CS-g-Por NPs）。將CS-g-Por 納米粒子加入到pH 1鹽酸中處理，通過Schiff 堿鍵分解和卟啉基團自組裝，形成刺突形貌，獲得表面粗糙的仿病毒形貌的納米粒子（VM-NPs）。

利用VM NPs 中殘留的戊二醛醛基與Tat 穿膜肽的氨基反應(yīng)，將Tat 穿膜肽修飾到VM NPs，得到VM-T NPs。VM-T NPs 中，穿膜肽與殼聚糖共價相連，類似于病毒的糖蛋白結(jié)構(gòu)。

通過VM NPs 表面的疏水性卟啉刺突結(jié)構(gòu)修飾脂質(zhì)1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）（~55 mol%）和膽固醇（~45 mol%），制備VM-L NPs。為利用Tat 穿膜肽和脂質(zhì)的的協(xié)同作用促進胞吞，進一步模擬病毒化學(xué)組成，利用上述組成的脂質(zhì)修飾連接Tat 穿膜的粒子VM-T NPs，得到VM-T-L NPs（圖2）。

圖2. 仿病毒納米粒子的表征。（A-C）（A）平滑CS-g-Por NPs，（B）仿病毒納米粒子VM NPs和（C）VM-T-L NPs的代表性TEM圖像。比例尺：200 nm。插圖是較高放大率的圖像。比例尺：100 nm。通過將CS-g-Por NPs在0.1 M HCl中處理15分鐘制備VM NPs。通過依次用Tat肽和HIV脂質(zhì)修飾VM NPs制備VM-T-L NPs。不同NPs在水中的（D）大小和（E）zeta電位。

2. 仿病毒納米粒子的胞吞

為研究仿病毒納米粒子對胞吞的影響，選擇HeLa 人類宮頸癌細(xì)胞、 HepG2人類肝癌細(xì)胞兩種細(xì)胞系。通過與表面相對光滑的CS-g-Por NPs、CS NPs 對比，以及VM-T-L NPs、VM-T NPs、VM-L NPs、VM NPs 間對比，研究仿病毒形貌和組成粒子對胞吞的影響。實驗結(jié)果表明，仿病毒形貌和組成的納米粒子極易被細(xì)胞吞噬，類似于病毒對細(xì)胞具有很強的侵染性。仿病毒形貌的 VM NPs 相比于光滑納米粒子 CS-g-Por NPs、CS NPs，可大大促進胞吞(圖3)。粒子負(fù)載光敏劑吲哚菁綠ICG后，HeLa 細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞對其胞吞與負(fù)載ICG 前類似（圖4）。

圖3. HeLa細(xì)胞對仿病毒納米粒子胞吞的定量和定性分析。（A-D）流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，將FITC標(biāo)記的納米粒子與HeLa細(xì)胞在80 μg/mL的濃度下共培養(yǎng)1 h和3 h后（A，B），以及分別以20、40和80 μg/mL的濃度共培養(yǎng)3 h后（C，D），其胞吞率（A，C）和胞吞量（B，D）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n =3，** p <0.01，在相同的實驗條件下，VM-T-L、VM-T和VM-L NPs vs. VM、CS-g-Por和CS NPs。（E-J）HeLa細(xì)胞與VM-T-L NPs（E）、VM-T NPs（F）、VM-L NPs（G）、VM NPs（H）、CS-g-Por NPs（I）和CS NP（J）在濃度為80 μg/mL下共培養(yǎng)3 h后的CLSM圖像。綠色、紅色和藍(lán)色分別代表納米粒子、溶酶體和細(xì)胞核。

圖4. 負(fù)載ICG的納米粒子的表征以及HeLa細(xì)胞對負(fù)載ICG的納米粒子吞噬的定量分析。（A，B）水中不同負(fù)載ICG納米粒子的zeta電位（A）和大小（B）。（C，D）流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在以80 μg/mL（ICG 負(fù)載量20 μg/mL） 分別共培養(yǎng)1 h和3 h后，其胞吞率（C）和胞吞量（D）。（C，D）中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3，** p <0.01，在相同的實驗條件下，VM-T-L@ICG、VM-T@ICG和VM-L@ICG NP vs. VM @ ICG、CS-g-Por@ICG和CS@ICG NPs。

3. 負(fù)載ICG仿病毒納米粒子的體外光熱治療（PTT）效果

通過MTT 法檢測負(fù)載ICG粒子對HeLa 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞的光熱殺傷效果。結(jié)果顯示，仿病毒納米粒子促進了所負(fù)載的ICG 的細(xì)胞傳遞，光照下引起細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的急劇升高，從而增強了細(xì)胞毒性，對細(xì)胞起到殺傷作用（圖5）。相同濃度下，按ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG、VM@ICG、 VM-L@ICG、VM-T@ICG、VM-T-L@ICG 的順序，光熱殺傷細(xì)胞的效果依次增加。例如100 μg/mL 時，VM-T-L@ICG 、VM-T@ICG、VM-L@ICG 細(xì)胞存活率分別只有14%、18%和20%；形成明顯對比的是，相同條件下ICG、CS-g-Por@ICG 和CS@ICG 細(xì)胞存活率仍高達(dá)80%以上。

圖5. 負(fù)載ICG納米粒子的體外光熱效應(yīng)和光熱治療效果檢測。（A）光照下（808 nm，1 W/cm²），負(fù)載ICG的納米粒子和游離ICG的光熱效應(yīng)。（B-G）疊加的熒光和明場顯微鏡圖像，顯示HeLa細(xì)胞與濃度為100 μg/mL（ICG負(fù)載量25 μg/mL）的VM-T-L@ICG（B）、VM-T@ICG（C）、VM-L@ICG（D）、VM@ICG（E），CS-g-Por@ICG（F）和CS@ICG（G）共培養(yǎng)3小時，然后進行光照（808 nm，1 W/cm²，10 s）后ROS的產(chǎn)生。（H）HeLa細(xì)胞中ROS的相對濃度。數(shù)據(jù)為分析顯微鏡圖像中熒光強度獲得。（I）將HeLa細(xì)胞與濃度為75 μg/mL（ICG負(fù)載量18 μg/ mL）或100 μg/mL（ICG負(fù)載量25 μg/mL）的負(fù)載ICG納米粒子和18 μg/mL或25 μg ICG共培養(yǎng)3 h，再分別光照（808 nm，1 W/cm²，30 s）或不光照后的細(xì)胞活性。（J）將HeLa細(xì)胞與100 μg/mL（負(fù)載量25μg/mL）負(fù)載ICG納米粒子和25 μg/mL ICG共培養(yǎng)3 h，再進行光照（808 nm，1 W/cm²，30 s）或不進行光照后，凋亡檢測結(jié)果。（H-J）中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n =5，* p <0.05，在相同的實驗條件下VM-T-L@ICG、VM-T@ICG和VM-L@ICG NPs vs. VM@ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG NPs和ICG。

4. 負(fù)載ICG仿病毒納米粒子的體內(nèi)光熱治療效果

利用帶有HeLa 腫瘤的裸鼠進行了負(fù)載ICG 納米粒子體內(nèi)光熱治療研究。與其他各組形成鮮明對比的是，光照下VM-T-L@ICG 實驗組在21 天后未發(fā)現(xiàn)腫瘤，說明腫瘤被完全清除（圖6）。可以推斷，當(dāng)負(fù)載ICG 的納米粒子注入到腫瘤中后，由于VM-T-L@ICG 納米粒子能夠顯著促進胞吞，ICG 的細(xì)胞傳遞效率顯著高于其他組。

圖6. 負(fù)載ICG仿病毒納米粒子的體內(nèi)光熱效應(yīng)。（A）分別被指定處理并培養(yǎng)21天后，裸鼠中的腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 5，** p <0.01，與其他組相比。“ L”代表激光照射（808 nm，1 W/cm²，5 min）。每組中的每只小鼠被注射指定的負(fù)載有25 μg ICG的納米粒子或25 μg ICG。（B-E）Ki-67染色的從小鼠采集的腫瘤光學(xué)圖像。小鼠用（B）VM-T-L@ICG+L、（C）CS-g-Por@ICG+L、（D）CS@ICG+L和（E）ICG+L 治療后21天采集的腫瘤。（F）在808 nm激光照射不同時間下，VM-T-L@ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG、ICG和生理鹽水對荷瘤小鼠的光熱效應(yīng)。（G，I）CLSM圖像和（H，J）CLSM、明場疊加圖像，顯示了VM-T-L@ICG納米粒子（綠色熒光）在荷HeLa瘤小鼠體內(nèi)向腫瘤中的滲透。（I）和（J）分別是（G）和（H）中矩形區(qū)域的相應(yīng)放大圖像。