【科研摘要】

先前，以色列耶路撒冷希伯來大學Chen Wang和Itamar Willner研究團隊在《Chemical Science》上發表題為Biocatalytic reversible control of the stiffness of DNA-modified responsive hydrogels: applications in shape-memory, self-healing and autonomous controlled release of insulin論文呢。他們將葡萄糖氧化酶（GOx），乙酰膽堿酯酶（AchE）和脲酶（它們驅動生物催化轉化以改變pH值）整合到基于pH響應的基于DNA的水凝膠中。

團隊提出了由GOx/脲酶或AchE/脲酶組成的兩酶負載水凝膠和由GOx/AchE/脲酶組成的三酶負載水凝膠。水凝膠內的生物催化轉化導致要求的核酸橋的重新配置以及對各個水凝膠的剛度的可切換控制。可切換的剛度特征用于開發生物催化引導的形狀記憶和自愈基質。此外，在加載GOx/胰島素在pH響應得DNA水凝膠中會產生葡萄糖觸發的基質，以控制胰島素的釋放，從而起到人造胰腺的作用。胰島素的釋放受葡萄糖濃度的控制，因此，負載生物催化胰島素的水凝膠為控制糖尿病提供了有趣的感官和治療載體。具體過程步驟如圖1所示。

圖1 使用三種不同的生物催化劑（GOx，AchE和脲酶）和兩種不同的基序（T–A·T三鏈體和i-基序結構）作為可重構的交聯劑，對基于刺激的基于DNA的水凝膠的pH進行可逆的生物催化控制。

【圖文解析】

制備與性能

第一種刺激響應性生物催化水凝膠系統的制備和性能如圖2所示。聚丙烯酰胺支架PA是通過丙烯酰胺與丙烯酸酯核酸單體（1）和（2）的共聚反應制得的。通過紫外光譜對聚合物鏈上的酸（（1）+（2））進行評估，結果為1：58（DNA：丙烯酰胺）。系鏈（1）包含一個自互補序列，而系鏈（2）設計為在鏈（3）存在的情況下生成一個T–A·T三元組。在鏈（3），葡萄糖氧化酶（GOx）和脲酶的存在下，聚合物PA產生通過（1）/（1）雙鏈體和（2）/（3）/ （2）T–A·T三元組（路徑I）。另一種相關的生物催化水凝膠包括在（1）/（1）和（2）/（3）/（2）協同交聯的水凝膠中加入乙酰膽堿酯酶（AchE）和脲酶（路徑II）。水凝膠中的酶GOx，脲酶和AchE的裝載量分別對應于23、28和27個單位。對于制備不同核酸修飾的水凝膠的合成細節，需要對不同聚合物上的核酸負載量進行評估，以及本研究中使用的各個DNA的詳細序列，以及對不同生物催化劑的含量進行評估的細節。負載的生物催化劑改變水凝膠硬度的機理如圖1和2a所示。

圖2 （a）使用可切換的，生物催化的，pH刺激的T–A·T三聯體構型，制備和可逆控制GOx /脲酶（路徑I）或AchE /脲酶負載（路徑II）DNA水凝膠的剛度交聯劑。（b）在葡萄糖（a'/ a'）和尿素（b'/ b'）存在的情況下，裝有GOx /脲酶的水凝膠的流變特性。（c）在存在葡萄糖（狀態I）和尿素（狀態II）的情況下，水凝膠的剛性特性（路徑I）可切換。（d）在乙酰膽堿（a'/ a''）和尿素（b'/ b''）存在下負載AchE /脲酶的水凝膠的流變特性。（e）在存在乙酰膽堿（狀態I）和尿素（狀態II）的情況下，水凝膠（路徑II）的可轉換剛度特性。（f）在存在葡萄糖（圖I）和尿素（圖II）的情況下水凝膠（路徑I）的SEM圖像。

形狀記憶

然后對不同水凝膠的剛度進行了生物催化控制，以開發出具有形狀記憶特性的水凝膠基質。即，使通過雙鏈體（1）/（1）和酶反應橋鍵交聯的成形的，較高剛度的水凝膠經受相應的底物，將水凝膠轉變成較低剛度的準液體狀態，使其穩定僅通過（1）/（1）雙工橋。然而，殘余的雙鏈橋提供了由聚合物鏈的規定纏結反映的記憶。在協同橋聯的水凝膠的抗生物催化再生后，雙鏈“記憶”單元提供了指導信息，以再生成形的，更高剛度的水凝膠。這在圖4a中以GOx /脲酶或AchE /脲酶負載的水凝膠的應用為例，它們通過（1）/（1）雙鏈體和（2）/（3）/（2）三鏈體協同交聯，例如生物催化形狀記憶矩陣。在模具中制備了負載有生物催化劑的硬質水凝膠，并將其擠出為三角形。使水凝膠經受尿素分離，使三鏈橋分離，從而導致較低硬度，僅通過雙鏈體（1）/（1）交聯的無形基質。用葡萄糖或乙酰膽堿處理準液體，無定形基質會導致水凝膠的中和，并通過兩個協同交聯單元穩定的記憶引導的三角形水凝膠的重塑。類似地，圖4b證明了可通過（1）/（1）和（4）/（6）//（7）/協同穩定的GOx /脲酶或AchE /脲酶負載的水凝膠的可逆形狀記憶（5）交聯劑。在用葡萄糖/尿素或乙酰膽堿/尿素處理水凝膠時，實現了三角形和無形的準液體水凝膠的可逆轉變。

圖4（a）負載GOx/脲酶或AchE/脲酶的水凝膠的生物催化導向的可逆形狀記憶特性。

如圖6所示，通過三種負載酶控制水凝膠的剛度，以控制多重觸發的形狀記憶特征。三角形高剛度的水凝膠通過（2）交聯。/（3）/（2）三聯橋和（4）/（6）//（7）/（5）交聯單元。將三角形水凝膠（狀態I）置于尿素中會導致較低的剛度，準液態狀態III，其中（4）/（6）//（7）/（5）橋充當內部記憶。添加葡萄糖后中和基質會導致狀態I的定型硬水凝膠的記憶引導再生。隨后通過乙酰膽堿對定型水凝膠進行酸化會導致無定型，低剛度狀態II，其中僅包含（ 2）/（3）/（2）三重橋作為內存。隨后用尿素處理水凝膠將中和基質，從而導致（2）/（3）/（2）引導的剛性三角形水凝膠再生。最后，用葡萄糖處理堅硬的中性水凝膠會重新酸化基質，從而導致僅通過（2）/（3）/（2）記憶橋交聯的無形基質。

圖6 T–A·T和尿素，葡萄糖或乙酰膽堿引導的超分子雙鏈體交聯的三酶負載水凝膠的循環形狀記憶特征。

人工胰腺藥釋

GOx催化的水凝膠基質中胰島素的釋放表明，酶響應性水凝膠可以引入一種概念來定制“人工胰腺”，其中水凝膠充當胰島素自主引導葡萄糖釋放的載體。因此，作者將GOx和香豆素標記的胰島素整合在較高硬度的水凝膠基質中，如圖9a所示。圖9b描繪了在存在可變濃度的葡萄糖的情況下香豆素標記的胰島素從水凝膠中的時間依賴性釋放。胰島素的釋放進行了約30分鐘后，由于過程中消耗的葡萄糖濃度降低，達到飽和狀態。確實，用血糖儀監測葡萄糖濃度顯示了水凝膠中葡萄糖的迅速減少（圖9c）。使達到飽和胰島素釋放水平的葡萄糖反應性GOx/加載胰島素的水凝膠經受額外的高濃度葡萄糖開啟胰島素的釋放（圖9d）。水凝膠展示了葡萄糖控制的可切換釋放功能，可實現自主操作。

圖9通過（1）/（1）和pH響應（4）/（6）//（7）/（5）超分子雙鏈體交聯的負載胰島素的葡萄糖響應水凝膠的應用：（a）示意圖 剛性胰島素負載葡萄糖反應性水凝膠的結構。（b）在不同濃度的葡萄糖存在下胰島素從水凝膠中的時間依賴性釋放。（c）用GOx/過氧化氫酶負載的水凝膠處理的母體葡萄糖溶液中葡萄糖的時間依賴性消耗。（d）“人造胰腺”水凝膠通過葡萄糖刺激的胰島素可轉換釋放。

總結：該研究已將酶整合到基于DNA的水凝膠中，以此來控制其硬度。將兩種或三種不同的酶加載到核酸橋接的聚丙烯酰胺水凝膠中。引起水凝膠酸化的生物催化劑是葡萄糖氧化酶（GOx）和乙酰膽堿酯酶（AchE），而將基本條件引入水凝膠的酶是脲酶。水凝膠通過兩種pH響應橋協同交聯，其中在尿素酶催化的尿素分解產生的堿性條件下，T–A·T橋聯單元解離，雙鏈核酸通過其重構結構分離為i-酸性條件下的基序結構，這是通過生物催化好氧GOx催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸和H₂O₂或通過AchE催化乙酰膽堿水解為乙酸和膽堿而產生的。通過各個核酸交聯單元的選擇性pH刺激分離，證明了對水凝膠硬度的控制。實際上，其他酶，例如磷酸酶或碳酸酐酶，也可以用于控制水凝膠中的pH條件。酶指導的對水凝膠硬度的可切換控制提供了開發生物催化驅動的形狀記憶和自我修復基質的新方法。另外，水凝膠的生物催化轉換的剛度性質用于底物觸發的受控藥物釋放。具體地，葡萄糖觸發的對GOx /胰島素負載的水凝膠的剛度的控制和葡萄糖劑量控制的胰島素釋放提供了通過釋放的胰島素自主調節葡萄糖水平的手段。可以設想將本文所述的GOx /過氧化氫酶/胰島素負載的水凝膠沉積在毛細管微針陣列上，將其作為一種功能裝置，充當人造胰腺。水凝膠/微針陣列可充當皮膚上的貼劑，用于自主感測皮下流體中的葡萄糖，隨后自主釋放胰島素并將其螯合遞送至身體。

參考文獻：doi.org/10.1039/D0SC01319F

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