【背景了解】

多年來，用于蛋白質結合和組裝的新方法為各種生物活性蛋白質水凝膠開辟了場所。這些基于蛋白質的材料因其遺傳可編程性和功能多樣性而聞名，它們已成為替代其他天然或合成聚合物的有前途的替代品。例如，使用SpyTag/SpyCatcher或SnoopTag/SnoopCatcher等基因編碼的點擊化學試劑（一種可以通過形成異肽鍵將蛋白質分子共價結合在一起的肽/蛋白質對）導致了各種水凝膠和“活”軟材料。與由合成聚合物或天然前體制備水凝膠的努力相比，這種設計水凝膠的方法的優勢在于，它無需化學修飾，并具有更好的細胞或生物相容性。然而，為了形成生物活性水凝膠，必須明智地將那些蛋白質構件設計為具有適當的多個反應域，就容易制造和生物功能化而言，很難將其推廣。

【科研摘要】

軸突再生構成了再生神經生物學的一項基本挑戰，這需要使用量身定制的生物材料來控制細胞和生物分子的傳遞。創建這些材料的一種越來越流行的方法是將工程蛋白質直接組裝成高階結構，該過程通常依賴于復雜的蛋白質化學。先前，香港科技大學Bojing Jiang，Chao Yang和南方科技大學Xiaotian Liu等研究人員提出了一種簡單的方法，用于通過His6標簽蛋白的金屬定向組裝來創建可注射的光響應水凝膠。相關論文題為Injectable, photoresponsive hydrogels for delivering neuroprotective proteins enabled by metal-directed protein assembly發表在《Science Advances》上。B12依賴的感光蛋白CarHC可以通過氨基末端His6-tag與過渡金屬離子絡合，添加AdoB12后可以進一步經歷溶膠-凝膠轉變，從而形成具有明顯可注射性和光降解性的水凝膠。可誘導的相變進一步使得細胞和蛋白質的容易包封和釋放成為可能。將注射有白血病抑制因子修飾的Zn²⁺配位的凝膠注射到受傷的小鼠視神經中，導致延長的細胞信號傳導和增強的軸突再生。這項研究說明了設計可注射生物材料的有效策略。

【圖文解析】

1. 設計蛋白質構建體

為了檢查使用金屬離子將His6標記的重組蛋白組裝到水凝膠中同時保留其分子功能的可行性，作者選擇了His6標記的重組蛋白SpyTag-ELP-CarHC-ELP-SpyTag（ACA）作為模型系統（圖1），以前在大腸桿菌中表現出明顯的溶解性和表達產量。該構建體的主要結構域CarHC是B12依賴的感光體，它來自細菌轉錄調節劑，可控制類胡蘿卜素色素的生物合成。AdoB12中的C-Co鍵對綠光（522 nm）敏感。CarHC在黑暗中與輔因子AdoB12結合后會自組裝成四聚體，而在光照下會分解成單體，伴隨著AdoB12中不穩定的C-Co鍵的裂解，4'，5'-脫水腺苷的釋放和 His132與Co中心的協調（圖1）。

圖1將帶有His6標簽的CarHC金屬定向組裝成光響應水凝膠。

2金屬導向的蛋白質組裝

在時間掃描模式下的流變學測量表明，在黑暗中添加AdoB12后，ACA/M²⁺復合物的膠凝動力學，其儲能模量G'（實質上大于損耗模量G''）在15分鐘內達到了平穩狀態（圖2A）。對所有四種類型的M2 +配位的凝膠進行掃頻測試，發現在0.01至100 rad/s的頻率范圍內，G'~1 kPa和G''~0.1 kPa，證實了固體物質的形成（圖2B）。只有Cu²⁺配位的凝膠顯示出G'和G''高度依賴于剪切頻率，而其他的則沒有。在0.03 rad/s的頻率處出現了G”的局部最大值，表明該材料具有粘彈性（圖2B）。金屬離子對給電子基團的親和力通常遵循Cu²⁺>Ni²⁺> Zn²⁺≈Co²⁺的順序，而它們對特定配體的選擇性相反（Cu²⁺<Ni²⁺< Zn²⁺≈Co²⁺）。

圖2.金屬配位蛋白網絡的物理性質。

在黑暗中將凝膠與tris緩沖鹽水（TBS）浸沒在一起，導致5天后蛋白質損失少于10％，顯示出這些金屬配位蛋白質網絡的顯著穩定性（圖2C）。同時，這些M²⁺配位的凝膠在連續白光發光二極管（LED）照明（35 klux）下經歷了快速的凝膠-溶膠轉變，并伴隨著G'的明顯降低，其強度可與室外日光（~10至 根據美國國家光學天文臺（100 klux）（圖2D）。這種光誘導的相變可歸因于AdoB12的光解和蛋白質網絡內四聚體CarHC的分解（圖1）。

3.氧化還原反應性鈷協同蛋白網絡

Co²⁺絡合物在熱力學上是不穩定的，并且在動力學上不穩定，這與Co³⁺絡合物在熱力學上穩定并且配體交換明顯緩慢形成鮮明對比。這種對比度是Co²⁺/Co³⁺所獨有的，最近已被用于制造具有明顯氧化還原反應性的水凝膠。

4.自修復和可注射性

應變掃描測試顯示線性粘彈性區域具有變化的線性極限，線性極限取決于金屬離子（圖3，A至D）。含Co，Ni，Cu和Zn的凝膠分別在γy~100、70、50和141％處顯示線性極限（屈服點），并且流動點（G'和G''曲線交叉，在γf分別為158％，177％，100％和250％時（圖3，A至D）。連續的階躍應變測量表明，在網絡故障后，這些水凝膠可快速恢復。通過施加高應變（250％）500 s破壞水凝膠網絡，從而導致呈液體狀（G''> G'）。切換到低振幅應變（5％）可立即恢復實體力學（G'> G”）；即使在網絡破裂6個周期后，G仍可以恢復（圖3，E至H）。

圖3在金屬配位的CarHC水凝膠上進行的應變掃描測試。

5.細胞包封和光誘導釋放

對于基礎研究和基于細胞的療法而言，能夠輕松封裝和回收細胞的物質系統是非常需要的。

首先檢查了它們封裝小鼠3T3成纖維細胞和人間充質干細胞（hMSCs）的能力。將細胞懸浮在ACA / Zn²⁺（1：2）溶液中，然后添加AdoB12以引發凝膠化。45分鐘后，將凝膠浸入培養基中，并在黑暗中（37°C，5％CO2）孵育12小時。進行標準活/死染色測定以確定細胞活力。事實證明，封裝12小時后，大多數成纖維細胞（90.0±3.6％）和MSC（88.0±1.4％）仍然可以存活（圖4），證實了這些Zn²⁺配位的凝膠的細胞相容性。

圖4光誘導的封裝細胞釋放。

光照后，包封的細胞可在8分鐘內輕松地從Zn2 +凝膠中釋放出來，并伴隨著凝膠-溶膠轉變（圖4）。這些金屬配位的光響應水凝膠具有低毒性并且能夠容易地進行細胞包封和回收，可以代表用于三維（3D）細胞培養和細胞移植的通用系統。

6.固定和釋放His6標簽的蛋白

由于蛋白質藥物通常在體內具有短暫的半衰期，因此可控的釋放/釋放提供了提高其功效的可能途徑。作者預見到，His6標記的蛋白可以很容易地通過金屬配位固定在水凝膠網絡上，然后可以通過光誘導的凝膠-溶膠轉變而釋放出來。

7.載有LIF的水凝膠用于持續信號轉導和轉錄激活因子3的激活

先前的研究已經確定LIF具有神經保護作用，并促進軸突生長。還已經表明，將這種細胞因子注射到病變部位導致神經突生長增強，盡管程度適中。神經組織的剛度從接近人腦皮質板的~150 Pa到其根尖表面的~1500 Pa，與Zn²⁺配位的CarHC凝膠的G'（~1 kPa）相當。5天后，在黑暗和正常晝夜節律條件下，接受LIF載膠的視神經中STAT3磷酸化水平仍然很高，而使用LIF溶液的視神經中STAT3磷酸化水平仍然很高。不論光照條件如何，在注射了LIF的凝膠后5天，觀察到大約60％的p-STAT3陽性RGC（圖5）。

圖5帶有Zn²⁺配位的凝膠的His6標簽LIF的可注射遞送激活了STAT3途徑。

8.載有LIF的水凝膠促進軸突再生

使用視神經擠壓模型進一步研究了這些富含LIF的水凝膠對神經保護和軸突再生的影響。在視神經擠壓后，向C57BL/6小鼠玻璃體內注射媒介物（TBS），TBS中的LIF溶液或載有LIF的凝膠。雖然注射LIF溶液對視神經壓傷2周后對病變部位的RGC存活率幾乎沒有影響，但在黑暗和正常情況下，載有LIF的凝膠的給藥會使活RGC的數量增加約30％晝夜節律條件，這些凝膠在體內顯示出更好的神經保護作用。

與TBS處理的小鼠相比，軸突再生很少（約200個）穿過病變部位，而注射LIF溶液或載有LIF的凝膠可顯著增強軸突再生，特別是在≥0.2mm的軸突再生中。長度（圖6）。此外，在正常的晝夜節律和黑暗條件下，用載有LIF的凝膠處理的組均顯示出大量的再生軸突，其長度≥0.2 mm（亮，~1600；暗，~1800），比用LIF處理的組更多。LIF溶液（~900），表明這些蛋白質凝膠傳遞LIF能夠促進軸突再生（圖6）。

圖6.帶有Zn²⁺配位的凝膠的His6標簽LIF的可注射遞送促進視神經中的軸突再生。

參考文獻：

DOI: 10.1126/sciadv.abc4824