【背景了解】

多年來(lái)，用于蛋白質(zhì)結(jié)合和組裝的新方法為各種生物活性蛋白質(zhì)水凝膠開(kāi)辟了場(chǎng)所。這些基于蛋白質(zhì)的材料因其遺傳可編程性和功能多樣性而聞名，它們已成為替代其他天然或合成聚合物的有前途的替代品。例如，使用SpyTag/SpyCatcher或SnoopTag/SnoopCatcher等基因編碼的點(diǎn)擊化學(xué)試劑（一種可以通過(guò)形成異肽鍵將蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合在一起的肽/蛋白質(zhì)對(duì)）導(dǎo)致了各種水凝膠和“活”軟材料。與由合成聚合物或天然前體制備水凝膠的努力相比，這種設(shè)計(jì)水凝膠的方法的優(yōu)勢(shì)在于，它無(wú)需化學(xué)修飾，并具有更好的細(xì)胞或生物相容性。然而，為了形成生物活性水凝膠，必須明智地將那些蛋白質(zhì)構(gòu)件設(shè)計(jì)為具有適當(dāng)?shù)亩鄠€(gè)反應(yīng)域，就容易制造和生物功能化而言，很難將其推廣。

【科研摘要】

軸突再生構(gòu)成了再生神經(jīng)生物學(xué)的一項(xiàng)基本挑戰(zhàn)，這需要使用量身定制的生物材料來(lái)控制細(xì)胞和生物分子的傳遞。創(chuàng)建這些材料的一種越來(lái)越流行的方法是將工程蛋白質(zhì)直接組裝成高階結(jié)構(gòu)，該過(guò)程通常依賴于復(fù)雜的蛋白質(zhì)化學(xué)。先前，香港科技大學(xué)Bojing Jiang，Chao Yang和南方科技大學(xué)Xiaotian Liu等研究人員提出了一種簡(jiǎn)單的方法，用于通過(guò)His6標(biāo)簽蛋白的金屬定向組裝來(lái)創(chuàng)建可注射的光響應(yīng)水凝膠。相關(guān)論文題為Injectable, photoresponsive hydrogels for delivering neuroprotective proteins enabled by metal-directed protein assembly發(fā)表在《Science Advances》上。B12依賴的感光蛋白CarHC可以通過(guò)氨基末端His6-tag與過(guò)渡金屬離子絡(luò)合，添加AdoB12后可以進(jìn)一步經(jīng)歷溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，從而形成具有明顯可注射性和光降解性的水凝膠。可誘導(dǎo)的相變進(jìn)一步使得細(xì)胞和蛋白質(zhì)的容易包封和釋放成為可能。將注射有白血病抑制因子修飾的Zn²⁺配位的凝膠注射到受傷的小鼠視神經(jīng)中，導(dǎo)致延長(zhǎng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和增強(qiáng)的軸突再生。這項(xiàng)研究說(shuō)明了設(shè)計(jì)可注射生物材料的有效策略。

【圖文解析】

1. 設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)構(gòu)建體

為了檢查使用金屬離子將His6標(biāo)記的重組蛋白組裝到水凝膠中同時(shí)保留其分子功能的可行性，作者選擇了His6標(biāo)記的重組蛋白SpyTag-ELP-CarHC-ELP-SpyTag（ACA）作為模型系統(tǒng)（圖1），以前在大腸桿菌中表現(xiàn)出明顯的溶解性和表達(dá)產(chǎn)量。該構(gòu)建體的主要結(jié)構(gòu)域CarHC是B12依賴的感光體，它來(lái)自細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，可控制類胡蘿卜素色素的生物合成。AdoB12中的C-Co鍵對(duì)綠光（522 nm）敏感。CarHC在黑暗中與輔因子AdoB12結(jié)合后會(huì)自組裝成四聚體，而在光照下會(huì)分解成單體，伴隨著AdoB12中不穩(wěn)定的C-Co鍵的裂解，4'，5'-脫水腺苷的釋放和 His132與Co中心的協(xié)調(diào)（圖1）。

圖1將帶有His6標(biāo)簽的CarHC金屬定向組裝成光響應(yīng)水凝膠。

2金屬導(dǎo)向的蛋白質(zhì)組裝

在時(shí)間掃描模式下的流變學(xué)測(cè)量表明，在黑暗中添加AdoB12后，ACA/M²⁺復(fù)合物的膠凝動(dòng)力學(xué)，其儲(chǔ)能模量G'（實(shí)質(zhì)上大于損耗模量G''）在15分鐘內(nèi)達(dá)到了平穩(wěn)狀態(tài)（圖2A）。對(duì)所有四種類型的M2 +配位的凝膠進(jìn)行掃頻測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在0.01至100 rad/s的頻率范圍內(nèi)，G'~1 kPa和G''~0.1 kPa，證實(shí)了固體物質(zhì)的形成（圖2B）。只有Cu²⁺配位的凝膠顯示出G'和G''高度依賴于剪切頻率，而其他的則沒(méi)有。在0.03 rad/s的頻率處出現(xiàn)了G”的局部最大值，表明該材料具有粘彈性（圖2B）。金屬離子對(duì)給電子基團(tuán)的親和力通常遵循Cu²⁺>Ni²⁺> Zn²⁺≈Co²⁺的順序，而它們對(duì)特定配體的選擇性相反（Cu²⁺<Ni²⁺< Zn²⁺≈Co²⁺）。

圖2.金屬配位蛋白網(wǎng)絡(luò)的物理性質(zhì)。

在黑暗中將凝膠與tris緩沖鹽水（TBS）浸沒(méi)在一起，導(dǎo)致5天后蛋白質(zhì)損失少于10％，顯示出這些金屬配位蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的顯著穩(wěn)定性（圖2C）。同時(shí)，這些M²⁺配位的凝膠在連續(xù)白光發(fā)光二極管（LED）照明（35 klux）下經(jīng)歷了快速的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變，并伴隨著G'的明顯降低，其強(qiáng)度可與室外日光（~10至 根據(jù)美國(guó)國(guó)家光學(xué)天文臺(tái)（100 klux）（圖2D）。這種光誘導(dǎo)的相變可歸因于AdoB12的光解和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)四聚體CarHC的分解（圖1）。

3.氧化還原反應(yīng)性鈷協(xié)同蛋白網(wǎng)絡(luò)

Co²⁺絡(luò)合物在熱力學(xué)上是不穩(wěn)定的，并且在動(dòng)力學(xué)上不穩(wěn)定，這與Co³⁺絡(luò)合物在熱力學(xué)上穩(wěn)定并且配體交換明顯緩慢形成鮮明對(duì)比。這種對(duì)比度是Co²⁺/Co³⁺所獨(dú)有的，最近已被用于制造具有明顯氧化還原反應(yīng)性的水凝膠。

4.自修復(fù)和可注射性

應(yīng)變掃描測(cè)試顯示線性粘彈性區(qū)域具有變化的線性極限，線性極限取決于金屬離子（圖3，A至D）。含Co，Ni，Cu和Zn的凝膠分別在γy~100、70、50和141％處顯示線性極限（屈服點(diǎn)），并且流動(dòng)點(diǎn)（G'和G''曲線交叉，在γf分別為158％，177％，100％和250％時(shí)（圖3，A至D）。連續(xù)的階躍應(yīng)變測(cè)量表明，在網(wǎng)絡(luò)故障后，這些水凝膠可快速恢復(fù)。通過(guò)施加高應(yīng)變（250％）500 s破壞水凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致呈液體狀（G''> G'）。切換到低振幅應(yīng)變（5％）可立即恢復(fù)實(shí)體力學(xué)（G'> G”）；即使在網(wǎng)絡(luò)破裂6個(gè)周期后，G仍可以恢復(fù)（圖3，E至H）。

圖3在金屬配位的CarHC水凝膠上進(jìn)行的應(yīng)變掃描測(cè)試。

5.細(xì)胞包封和光誘導(dǎo)釋放

對(duì)于基礎(chǔ)研究和基于細(xì)胞的療法而言，能夠輕松封裝和回收細(xì)胞的物質(zhì)系統(tǒng)是非常需要的。

首先檢查了它們封裝小鼠3T3成纖維細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的能力。將細(xì)胞懸浮在ACA / Zn²⁺（1：2）溶液中，然后添加AdoB12以引發(fā)凝膠化。45分鐘后，將凝膠浸入培養(yǎng)基中，并在黑暗中（37°C，5％CO2）孵育12小時(shí)。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)活/死染色測(cè)定以確定細(xì)胞活力。事實(shí)證明，封裝12小時(shí)后，大多數(shù)成纖維細(xì)胞（90.0±3.6％）和MSC（88.0±1.4％）仍然可以存活（圖4），證實(shí)了這些Zn²⁺配位的凝膠的細(xì)胞相容性。

圖4光誘導(dǎo)的封裝細(xì)胞釋放。

光照后，包封的細(xì)胞可在8分鐘內(nèi)輕松地從Zn2 +凝膠中釋放出來(lái)，并伴隨著凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變（圖4）。這些金屬配位的光響應(yīng)水凝膠具有低毒性并且能夠容易地進(jìn)行細(xì)胞包封和回收，可以代表用于三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞移植的通用系統(tǒng)。

6.固定和釋放His6標(biāo)簽的蛋白

由于蛋白質(zhì)藥物通常在體內(nèi)具有短暫的半衰期，因此可控的釋放/釋放提供了提高其功效的可能途徑。作者預(yù)見(jiàn)到，His6標(biāo)記的蛋白可以很容易地通過(guò)金屬配位固定在水凝膠網(wǎng)絡(luò)上，然后可以通過(guò)光誘導(dǎo)的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變而釋放出來(lái)。

7.載有LIF的水凝膠用于持續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3的激活

先前的研究已經(jīng)確定LIF具有神經(jīng)保護(hù)作用，并促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。還已經(jīng)表明，將這種細(xì)胞因子注射到病變部位導(dǎo)致神經(jīng)突生長(zhǎng)增強(qiáng)，盡管程度適中。神經(jīng)組織的剛度從接近人腦皮質(zhì)板的~150 Pa到其根尖表面的~1500 Pa，與Zn²⁺配位的CarHC凝膠的G'（~1 kPa）相當(dāng)。5天后，在黑暗和正常晝夜節(jié)律條件下，接受LIF載膠的視神經(jīng)中STAT3磷酸化水平仍然很高，而使用LIF溶液的視神經(jīng)中STAT3磷酸化水平仍然很高。不論光照條件如何，在注射了LIF的凝膠后5天，觀察到大約60％的p-STAT3陽(yáng)性RGC（圖5）。

圖5帶有Zn²⁺配位的凝膠的His6標(biāo)簽LIF的可注射遞送激活了STAT3途徑。

8.載有LIF的水凝膠促進(jìn)軸突再生

使用視神經(jīng)擠壓模型進(jìn)一步研究了這些富含LIF的水凝膠對(duì)神經(jīng)保護(hù)和軸突再生的影響。在視神經(jīng)擠壓后，向C57BL/6小鼠玻璃體內(nèi)注射媒介物（TBS），TBS中的LIF溶液或載有LIF的凝膠。雖然注射LIF溶液對(duì)視神經(jīng)壓傷2周后對(duì)病變部位的RGC存活率幾乎沒(méi)有影響，但在黑暗和正常情況下，載有LIF的凝膠的給藥會(huì)使活RGC的數(shù)量增加約30％晝夜節(jié)律條件，這些凝膠在體內(nèi)顯示出更好的神經(jīng)保護(hù)作用。

與TBS處理的小鼠相比，軸突再生很少（約200個(gè)）穿過(guò)病變部位，而注射LIF溶液或載有LIF的凝膠可顯著增強(qiáng)軸突再生，特別是在≥0.2mm的軸突再生中。長(zhǎng)度（圖6）。此外，在正常的晝夜節(jié)律和黑暗條件下，用載有LIF的凝膠處理的組均顯示出大量的再生軸突，其長(zhǎng)度≥0.2 mm（亮，~1600；暗，~1800），比用LIF處理的組更多。LIF溶液（~900），表明這些蛋白質(zhì)凝膠傳遞LIF能夠促進(jìn)軸突再生（圖6）。

圖6.帶有Zn²⁺配位的凝膠的His6標(biāo)簽LIF的可注射遞送促進(jìn)視神經(jīng)中的軸突再生。

參考文獻(xiàn)：

DOI: 10.1126/sciadv.abc4824

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