具有光響應特性的材料尤其是水凝膠具有多種應用，包括自我修復、生物傳感、藥物輸送、聚合物結構和組織工程。基于硝基芐基（NB）交聯(lián)劑廣泛用于細胞培養(yǎng)和其他微生物。雖然如此，人們對微環(huán)境特別是密閉的水性環(huán)境（例如水凝膠）是如何影響NB部分裂解的方式和速率了解甚少，從而無法控制系統(tǒng)性能的局限性（例如快速水解或緩慢光解）。為了解決這些困難，美國 University of Delaware的April M. Kloxin團隊在《JACS》上發(fā)表了簡單新穎的方法。他們合成了包含不同不穩(wěn)定鍵（即酯，酰胺，碳酸根或氨基甲酸酯）NB并表征其光解和水解，并提出NB不穩(wěn)定鍵對材料降解的影響的獨特見解，這些NB鍵在水凝膠中充當不穩(wěn)定的交聯(lián)鍵。這些研究為控制光解和水解提供了新的化學方法，對光敏材料（如軟材料，納米顆粒、多肽、蛋白質(zhì)等）的設計提供了明確的指導。

 

1、設計帶有不穩(wěn)定鍵的NB交聯(lián)劑

作者提出了一種簡單而創(chuàng)新的方法，通過酯、酰胺、碳酸根或氨基甲酸酯修飾來調(diào)節(jié)NB交聯(lián)劑以及其水凝膠的水解和光解速率。他們合成了四種不同的NB不穩(wěn)定鍵化學（NB-酯，NB-酰胺，NB-碳酸酯和NB-氨基甲酸酯），并通過疊氮化物-炔烴環(huán)加成（SPAAC）與PEG-4-DBCO反應合成水凝膠（圖1A-B）。對水凝膠的光解和水解進行研究，確定這些不同降解機制在時間尺度差異（圖1C-D）。

圖1.（A）含有各種不穩(wěn)定鍵的硝基芐基（NB），X：氨基甲酸酯（藍色），酯（橙色），碳酸鹽（綠色）或酰胺（粉紅色）。（B）由含NB水凝膠的光降解及水降解。（C）通過SPAAC反應在PEG-4-DBCO和NB疊氮化物聚合形成三唑鍵，以此合成水凝膠。（D）在紫外光（365nm）照射下，NB光裂解導致水凝膠降解。（E）水凝膠在水性環(huán)境中降解的能力。

 

2、水凝膠的光解

通過測試光照射對水凝膠儲能模量（G’）的影響，作者研究了含四種不穩(wěn)定鍵的NB交聯(lián)劑的光解速率。光照導致鍵斷裂，水凝膠完全降解（即當水凝膠不再能夠存儲應力時）。水凝膠的儲能模量與交聯(lián)密度直接相關，可對一階反應動力學模型進行建模。具體來說，將標準化G’的自然對數(shù)相與時間作圖，并進行線性回歸擬合，可以確定水凝膠中每個交聯(lián)劑的有效一級光降解常數(shù)，通過有效一級光降解常數(shù)除以二就可獲得水凝膠中NB部分的光降解速率k。通過使用這種方法，他們發(fā)現(xiàn)在由NB氨基甲酸酯光降解速率最快，其次是NB酯，NB-碳酸根，最后是NB-酰胺（圖2B）。

為了比較溶液和水凝膠交聯(lián)中的NB之間的光降解差異，作者通過研究了含有5％氘化DMSO和PBS鹽溶液的水凝膠的NMR來評估NB基團的光降解動力學。他們觀察到NB-酰胺在溶液中的光降解速度最快，其次是NB-氨基甲酸酯，NB-酯和NB-碳酸酯。NB-酯，NB-碳酸酯和NB-氨基甲酸酯鍵在溶液和水凝膠之間的光降解速率沒有顯著差異，但是NB-酰胺水凝膠光降解速率顯著降低（圖2B）。NB-氨基甲酸酯在水凝膠中的光降解速率明顯快于其他NB交聯(lián)劑的光降解速率。作者提出當NB-酰胺在密閉環(huán)境（如樹脂或水凝膠）中充當交聯(lián)劑時，由于光散射，陰影效應和/或溶脹/溶劑化的影響，光降解速率會大大降低。與在溶液中相比，NB-酰胺在水凝膠的光降解速率降低，這可能使由于水凝膠網(wǎng)絡限制酰胺鍵的活化。在水凝膠中加入疏水性分子時，NB-酰胺在水凝膠的光降解速率沒有明顯降低。NB基團在光引發(fā)的光致異構化（Norrish II型）反應中產(chǎn)生的中間體會導致光降解減慢。水凝膠網(wǎng)絡對酰胺鍵的限制導致鍵構象和水合變化，這增加光異構化反應所需的熱力學驅動力。NB-酰胺交聯(lián)劑在水凝膠中光降解速率不夠快仍是在某些特定應用中的挑戰(zhàn)。

另一個觀察結果是NB-酰胺水凝膠在連續(xù)照射后30分鐘內(nèi)未完全降解，而帶有其他不穩(wěn)定鍵NB的水凝膠均完全降解。這種不完全降解是酰胺參與Norris II型反應而導致中間體發(fā)生位移引起的。作者用羰基清除劑（氨基脲）使NB-酰胺水凝膠進一步完全降解，這種清除劑有助于光裂解。

圖2.小分子和水凝膠的光降解速率。（A）水凝膠主鏈中的NB在365nm光照射下的β消除反應。（B）小分子和水凝膠紫外光（365 nm）照下的一階光降解速率和量子產(chǎn)率。

 

3、水凝膠的水解

NB不穩(wěn)定鍵的水解也可使水凝膠在較長時間內(nèi)降解。為了研究水凝膠對在不同水環(huán)境水解的差異，作者將水凝膠浸泡在PBS （pH = 10）中，并在72 h內(nèi)測量水凝膠體積（圖3）。在此條件下，水凝膠降解導致水凝膠體積增加（Q = V/V0），直到單鏈不再支撐網(wǎng)絡時水凝膠完全降解。NB-酯水凝膠在緩沖液中1小時內(nèi)便快速溶脹，然后完全降解（圖3）。NB-酯水凝膠水解速率最快，其次是NB-碳酸酯和NB-酰胺。NB-氨基甲酸酯水凝膠沒有明顯水解。NB-酯同時表現(xiàn)出快速的光降解和水解，而NB-酰胺則表現(xiàn)出較慢的光降解速率和較快的水解。NB-碳酸酯和NB-氨基甲酸酯具有與常見的NB不同的降解特性。NB-氨基甲酸酯具有快速光降解速率和極慢速水解速率。NB在生理條件下仍然水解，將水凝膠浸泡在PBS（pH = 7.4，含有1％青霉素/鏈霉素和0.2％真菌區(qū)）中，NB-酯在21天之內(nèi)降解，NB-碳酸水凝膠在49天之內(nèi)降解，NB-酰胺和NB-氨基甲酸酯未發(fā)生明顯變化。這對設計光降解水凝膠非常重要。

圖3. 水凝膠的水解。（A）NB基團的可裂解鍵（X）決定了水凝膠的水解速率和形成的產(chǎn)物，Z1和Z2分別代表形成的產(chǎn)物。（B）水凝膠在pH ＝ 10的PBS的體積變化。

 

4、NB交聯(lián)劑水凝膠釋放蛋白質(zhì)

作者最后設計了具有雙重功能的同心圓柱狀水凝膠，利用不同的NB交聯(lián)劑的水解和光解特性，以控制蛋白質(zhì)釋放。將不同熒光團標記的模型蛋白（BSA-Alexa Fluor（AF）488和BSA-AF647）分別加入NB-酯和NB-氨基甲酸酯水凝膠前體溶液中，然后在同心圓柱體模中依次形成水凝膠層。選擇NB-酯和NB-氨基甲酸酯是因為它們具有相似的光解行為及相反的水解行為，這提供了創(chuàng)建組合及順序釋放的機制。水凝膠光降解速率在共聚焦顯微鏡下進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩個水凝膠層內(nèi)的熒光強度均以相似的速率降低（圖4A），并且水凝膠相對高度在照射后降低（圖4B）。

 

圖4.雙功能同心圓柱水凝膠組合的蛋白釋放。（A）同心圓水凝膠隨光照時間的變化。（B）在0分鐘（左），7.5分鐘（中）和12.5分鐘（右）時，同心圓柱狀水凝膠的表面（頂部）和側面的圖像。比例尺500 μm。

 

接著，他們將水凝膠浸泡在PBS（pH = 10），NB-酯水凝膠層降解并釋放BSA-AF488。隨后用紫外光照射剩余的水凝膠以降解NB-氨基甲酸酯水凝膠層并釋放BSA-AF647。在堿性緩沖液中浸泡60分鐘后，NB-酯層的熒光強度降低，釋放出BSA-AF488，隨后在紫外光照射下NB-氨基甲酸酯層迅速釋BSA-AF647（圖5）。這證實了水凝膠中NB交聯(lián)劑的不同降解方式和速率在控制封裝及釋放的實用性。作者展示了一種通過簡單的過程來導向釋放的簡便方法，這種方法為設計具有可調(diào)節(jié)和可控制特性的可降解材料提供了新的思路和機會。

圖5.從雙重功能的同心圓柱水凝膠依次釋放蛋白質(zhì)。（A）NB-酯水凝膠層（綠色）在堿性條件下降解，而NB-氨基甲酸酯水凝膠層（紫色）在光照射才觀察到降解。 （B）在0分鐘（左），60分鐘（中）和75分鐘（右）的水凝膠圖像。比例尺500 μm。

參考文獻：https://doi.org/10.1021/jacs.9b11564