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【科學背景】

鉀離子(K⁺)是人體中最豐富的細胞內金屬，在調節(jié)細胞內液量，營養(yǎng)運輸以及通過神經(jīng)和肌肉收縮的細胞間通訊中起著至關重要的作用。另一方面，K⁺動態(tài)平衡的異常改變導致多種疾病，涉及心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，糖尿病，腎臟疾病和癌癥。由于細胞內和細胞外K⁺濃度之間的巨大差異（[K⁺]內= 150 mM，[K⁺]額外= 3-5 mM），對K⁺生理學和病理學的研究尚未得到滿足。相對缺乏可靠地測量生物樣本中細胞內K⁺動態(tài)變化的方法，這些方法滿足了對K⁺的低親和力和高選擇性的雙重挑戰(zhàn)，尤其是對鈉離子(Na⁺)而言，目前可用的熒光K⁺傳感器在很大程度上通過高親和力受體進行了優(yōu)化。更適合細胞外K⁺檢測。

【科研摘要】

最近，加州大學伯利克分校Christopher J. Chang教授團隊報告比例鉀離子傳感器1（RPS-1）的設計，合成和生物學評估，該傳感器是一種雙熒光團傳感器，能夠對活細胞內鉀離子進行比例熒光成像。相關論文A dual-fluorophore sensor approach for ratiometric fluorescence imaging of potassium in living cells發(fā)表在《Chemical Science》上。RPS-1通過鉀鍵將對鉀離子具有低親和力，高選擇性冠醚受體的鉀敏感熒光傳感器片段（PS525）與鉀不敏感的參比熒光團（香豆素343，Coumarin 343）通過酯鍵相連。在細胞內遞送后，酯酶定向的裂解將這兩種染料分裂成單獨的片段，從而可以按比例檢測K⁺。RPS-1對水性緩沖液中的K⁺有反應，對競爭性金屬離子具有高選擇性，并且在穩(wěn)態(tài)細胞內水平對鉀離子敏感，并且可以對從該基礎設定點開始的減少或增加做出反應。此外，RPS-1被用于比較篩選一組不同癌細胞系中的K⁺庫，揭示了轉移性乳腺癌細胞系相對于正常乳腺癌細胞的基礎細胞內K⁺升高。這項工作為研究細胞內鉀動力學提供了獨特的化學工具，并且是基于不依賴FRET或相關能量轉移設計的雙熒光團方法設計其他比例熒光傳感器的起點。

【圖文解析】

1. 比率鉀傳感器-1（RPS-1）的設計，一種用于比率鉀檢測的雙熒光探針

為了開發(fā)一種適合細胞內使用的鉀比例計量傳感平臺。原則上，鉀敏感部分應具有低親和力受體，以更好地匹配150 mM范圍內的高水平靜息細胞內K⁺池并通過基于強度的開啟響應做出響應，而鉀不敏感染料則應鉀傳感器顯示出獨特的光譜激發(fā)和發(fā)射，用于內部校準。由于缺乏對K⁺的熒光響應，作者選擇香豆素343作為內標熒光團，并針對傳感器的其他部分設計和合成了新的鉀敏感染料鉀傳感器525（PS525）（示意圖1a）。香豆素343通過兩個基于酯的接頭與PS525偶聯(lián)，得到RPS-1（示意圖1b）。RPS-1傳遞到細胞后，細胞酯酶將裂解酯鍵，以1：1的比例提供兩個單獨的熒光團PS525（對K⁺敏感）和香豆素343（對K⁺不敏感）（示意圖1c）。切割后，兩個熒光團由于其帶負電荷的羧酸根基團可被細胞捕獲。這樣，PS525和香豆素343的各自發(fā)射曲線的比率可以確定細胞內K⁺濃度的讀數(shù)。

示意圖1比例鉀傳感器1（RPS-1）的設計和作用。

2.K⁺響應型開啟探針鉀傳感器525（PS525）的合成與表征

由于RPS-1設計由與內部染料標準品相連的K⁺響應熒光部分組成，用于比例式校準，因此作者試圖制備一種新的開啟熒光傳感器，該傳感器在高細胞內[K⁺]范圍內對K⁺有選擇性地響應 150 mM。為了實現(xiàn)這一目標，選擇了套索狀醚修飾的氮雜-冠狀醚受體作為K⁺響應部分，因為與cryptand和G-quadruplex部分相比，它對K⁺保留的Na⁺選擇性高，但對K⁺的結合親和力較弱（圖 1b和2a）。

圖2 PS525的開啟響應和鉀選擇性。

示意圖2中顯示了K⁺反應性部分鉀離子傳感器525（PS525）的合成。套索醚改性的氮雜-冠醚1是使用已公開的方法合成的，然后在N，N-二甲基甲酰胺中使用磷酰氯，通過Vilsmeier-Haack反應，通過Vilsmeier-Haack反應轉化為氧雜蒽2，然后以三氟乙酸為溶劑進行間苯二酚縮合。Rhodol 3的合成方法是將2上的羥基轉化為三氟甲磺酸酯基，然后進行Buchwald-Hartwig胺化反應，添加叔丁氧羰基（Boc）保護的哌嗪基，并用痕量三氟乙酸處理。最后，通過使3與2-溴乙酸甲酯反應，然后在四氫呋喃和水的混合物中處理氫氧化鋰，獲得PS525。

示意圖2 PS525的合成。

作者評估了PS525在緩沖至生理pH（50 mM HEPES，pH 7.4）的水溶液中的光學性質。PS525顯示了在525 nm處的最大吸收峰，在存在K⁺的情況下，在0和200 mM的K⁺下，計算出的吸收系數(shù)分別為ε= 61 100 M^-1 cm^-1和ε= 65 000 M^-1 cm^-1（圖5）。當暴露于K⁺時，PS525的熒光發(fā)射集中在552 nm處開啟7倍（圖2b），量子產(chǎn)率從不存在K⁺時的0.03增加到存在K⁺時的0.15（圖2b）。根據(jù)Benesi–Hildebrand圖K⁺滴定反應，探針的K_d值計算為137 mM，與150 mM范圍內的細胞內[K⁺]匹配。

接下來，作者與一組生物學相關的堿金屬，堿土金屬和過渡金屬相比，測試了PS525對K⁺的金屬選擇性（圖2c）。值得注意的是，即使對K⁺的親和力很低，PS525在相關的細胞內水平上對Na⁺的選擇性也比對Na⁺高出五倍，這預示它對下游生物學應用具有足夠的敏感性和選擇性。然后，作者測試了PS525和香豆素343對細胞內K +濃度（140 mM）附近K⁺的比率響應的敏感性（圖2d）。在80 mM至120 mM的范圍內，進行線性回歸分析以計算5.8 mM的檢出限。另外，PS525和香豆素343的pH敏感性測試證明了它們在生理pH下的可用性。

3.由PS525和香豆素343染料合成鉀比例傳感器1（RPS-1）的方法以及活細胞中K⁺水平的比例熒光成像

在確定PS525是選擇性和敏感的熒光K⁺敏感染料單元后，作者將2-(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridine-3-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TATU) 作為碳酸鹽激活劑，通過將PS525與先前報道的香豆素synthon63酯化來合成RPS-1。作者測試了RPS-1的熒光響應和酯酶催化的水解。然后，將RPS-1用于通過共聚焦顯微鏡對細胞內K⁺池進行比例熒光成像，并考慮到PS525傳感單元能夠選擇性地對體外水性緩沖液中生物學相關濃度的K⁺水平做出反應。注意到，對K⁺不敏感的香豆素343的量子產(chǎn)率為0.02，與PS525部分相當，但在單獨的458 nm波長處被激發(fā)。在成像之前，首先將HeLa細胞與10μMRPS-1孵育，以確保探針攝取和酯酶裂解。使用Coumarin 343單元的458 nm激發(fā)（藍色通道）和PS525單元的514 nm（綠色通道）激發(fā)，獲得了雙色共焦顯微鏡圖像。然后使用這兩個通道（綠色通道/藍色通道，圖3b）獲得比率圖像。為了評估RPS-1是否可以通過其PS525單元響應細胞內K⁺的變化，然后用5μM纈霉素對HeLa細胞進行處理，這種化合物已知可以通過膜螯合和轉運鉀，并耗盡K⁺的細胞內池。在添加纈氨霉素后的0、5、15、30、45、60分鐘拍攝了來自兩個通道的共焦圖像，并與媒介物對照進行了比較。與媒介物對照組相比，作者觀察到了由纈氨霉素刺激的HeLa細胞中綠色/藍色比率強度的明顯降低（圖3c）。

圖3（a）RPS-1的合成和使用RPS-1的細胞內K⁺庫的比例成像。（b）使用RPS-1的基于時間的比例熒光成像可以監(jiān)測用5μM纈氨霉素處理1 h的活HeLa細胞中細胞內K⁺庫的消耗。綠色通道顯示在514 nm激發(fā)下來自PS525發(fā)色團的發(fā)射，藍色通道顯示在458 nm激發(fā)下來自香豆素 343發(fā)色團的發(fā)射。來自兩個通道的熒光比圖像由ImageJ構建。（c）通過ImageJ測量和分析繪制的多個生物學重復樣本的平均熒光強度比。

參考文獻：

doi.org/10.1039/D0SC03844J

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